Molekularbiologische Untersuchungen zur Identifizierung potentiell humaninfektiöser Trypanosoma (Trypanozoon) brucei-Isolate aus Süd-Ost Uganda

Abstract

Für die beiden humaninfektiösen Trypanosomen-Subspezies Trypanosoma brucei rhodesiense und T. b. gambiense existiert ein Reservoir von Haus- und Wildtieren. Morphologisch sind sie jedoch nicht von der allein tierinfektiösen Subspezies T. b. brucei unterscheidbar. Mit Hilfe von biologischen, biochemischen oder molekularbiologischen Methoden gelingt eine Differenzierung nur teilweise. Daher werden Testsysteme benötigt, die Tiere schnell und zuverlässig als Träger humaninfektiöser Trypanosomen identifizieren. In der vorliegenden Arbeit wurden 16 Trypanosomen-Referenzstämme und -klone (5 T. b. brucei, 9 T. b. gambiense und 2 T. b. rhodesiense), sowie 18 Feldstämme und 7 -klone aus Tieren und 4 Feldstämme aus Menschen in Bulutwe, einem Schlafkrankheits-Endemiegebiet im Südosten Ugandas, durch die Pulsfeld- Gelelektrophorese (PFGE) charakterisiert. Es sollte untersucht werden, ob anhand der spezifischen Karyotypen Rückschlüsse auf ihre Humanserumresistenz gezogen werden können. Um ihr Verhalten gegenüber Humanserum zu bestimmen, wurden die Stämme im in vitro-Humanserum- Resistenztest (HSRT) und teilweise im Blutinkubations-Infektiositätstest (BIIT) untersucht. Die Referenzstämme und -klone verhielten sich im HSRT erwartungsgemäß sensitiv (T. b. brucei) bzw. resistent (T. b. gambiense). Von den 2 T. b. rhodesiense-Stämmen verhielt sich der eine, wie zu erwarten, resistent, der andere jedoch sensitiv, was sich durch einen Verlust der Humanserumresistenz von T. b. rhodesiense nach Labortierpassagen bzw. Kultivierung ohne Humanserum erklären lässt. Von den 18 aus Tieren isolierten ugandischen Feldstämme verhielten sich 3 resistent, 6 subresistent und 9 sensitiv im HSRT. Die 7 Klone verhielten sich ebenfalls sensitiv, genau wie ihre Mutterstämme. Diese Ergebnisse waren nur teilweise identisch mit früher gewonnenen BIIT-Ergebnissen, was allerdings die Aussage unterstützt, dass T. b. rhodesiense ihre Humanserumresistenz verlieren können (s.o.). So zeigten ohne Humanserum passagierte Stämme bei meinen Untersuchungen z.T. einen geringeren Resistenzgrad als vorher, während 2 von mir zusammen mit Humanserum passagierte Stämme einen höheren Resistenzgrad aufwiesen. Die 4 aus Menschen isolierten ugandischen Feldstämme verhielten sich im HSRT erwartungsgemäß resistent. Von den 5 für den BIIT ausgewählten, aus Tieren isolierten Feldstämmen verhielten sich 3 resistent, 2 jedoch subresistent, obwohl sie anhand früherer BIIT-Ergebnisse als resistent eingestuft worden waren. Diese sich nur im Resistenzgrad unterscheidenden Ergebnisse können trotzdem als übereinstimmend gewertet werden. Die 3 ausgewählten menschlichen Isolate verhielten sich im BIIT erwartungsgemäß resistent. Für die PFGE-Untersuchungen der Trypanosomen-Karyotypen mussten sowohl die Probenaufbereitung als auch die Laufbedingungen zunächst optimiert werden. Mit 4 verschiedenen PFGE-Parameterlisten (Lauf 0-III) konnten Chromosomenbanden von 95kbp bis 3Mbp in einem jeweils 4,5cm hohen Agarosegel aufgetrennt werden. Dabei brachte der Einsatz von 2x10 9 Trypanosomen pro ml PSG-Puffer zur Herstellung der PFGE-Agaroseblöcke und deren anschließender Verdau mit 1mg Proteinase K pro ml NDS-Puffer für 48h gute Ergebnisse. Die DNA-Banden wurden 30min mit Ethidiumbromid gefärbt und über Nacht entfärbt. Das Gel wurde anschließend über UV-Licht fotografiert, zur Bildoptimierung in das Dokumentationsprogramm BioDoc ® (Biometra, Göttingen) übertragen und schließlich mit Hilfe des ScanPack 3.0 ® -Programmes (Biometra, Göttingen) ausgewertet. Die Untersuchungen zur Stabilität des Karyotypes von Trypanosomen zeigten, dass Blutstrom- und prozyklische Formen, frühe und späte Antigenvarianten oder Feldstämme und aus diesen gewonnene Klone identische Karyotypen besitzen. Die Karyotypen der Referenzstämme waren sehr unterschiedlich voneinander, und es ließen sich keine Gemeinsamkeiten ausmachen. In den Bereichen der Mini- (MC) und großen (MBC) Chromosomen zeigten alle Referenzen ungefähr vergleichbar viele Chromosomenbanden (durchschnittlich 4-7 MC und 4-6MBC). Nur von den Intermediär-Chromosomen (IC) besaßen die T. b. gambiense-Stämme durchschnittlich weniger (0-4 IC) als die nicht-gambiense-Stämme (3-6 IC). Eine Einteilung der Referenzen in humanserumresistent bzw. -sensitiv aufgrund von PFGE-Ergebnissen war nicht möglich. Auch konnten die 3 Trypanosoma brucei-Subspezies nicht eindeutig durch die PFGE identifiziert werden. Die aus Rindern und Schweinen in Bulutwe, Südost-Uganda isolierten Feldstämme stellten sich in ihren Karyotypen sehr viel homogener dar als die aus Menschen isolierten. Letztere waren untereinander genauso unterschiedlich wie die Referenzen. Ähnliche oder identische Karyotypen verschiedener Stämme konnten jedoch nur auf einen identischen Isolierungszeitraum bzw. dasselbe Isolierungstier zurückgeführt werden. Die durch das Dendrogramm entstandene Einteilung der Referenz- und Feldstämme bzw. -klone in 5 Gruppen (I-V) zeigte ebenfalls, dass in nahezu jeder Gruppe sowohl Humanserum-resistente bzw. -subresistente als auch -sensitive Stämme oder Klone enthalten sind. Gruppe IV beinhaltet als einzige nur resistente T. b. gambiense-Referenzen. Vom Karyotyp eines Stammes konnte also nicht auf seine Humanserumresistenz geschlossen werden. Auch konnte keine einzelne Bande identifiziert werden, die sich mit der Humanserumresistenz oder -sensitivität eines Stammes oder Klones in Verbindung bringen ließ. Die PFGE kann als einfach erlern- und durchführbare Methode Trypanosomen-Stämme spezifisch charakterisieren und selbst geringgradige Änderungen ihres Genotyps nachweisen. Trotzdem konnte in der vorliegenden Untersuchung anhand der Karyotypen der Stämme nicht auf ihre Humanserumresistenz oder Subspezies- Zugehörigkeit geschlossen werden. Grund hierfür ist die relativ geringe Sensitivität der PFGE, die auf der Ebene der Größenänderungen von Chromosomen liegt. Diese Größenänderungen entstehen bei Trypanosomen jedoch sehr häufig und zwar aufgrund immer wieder willkürlich auftretender Gen-Rearrangements. Um die Sensitivität der Methode zu erhöhen, könnte man, anstatt die intakten Chromosomen aufzutrennen, diese zunächst an definierten Schnittstellen durch Restriktionsenzyme in Chromosomen-Bruchstücke schneiden. Noch sensitiver, wenn auch Kontaminations-gefährdeter, wären PCR-Methoden, die eine Identifizierung von humaninfektiösen Trypanosomen-Isolaten erlauben.

A wide range of animal reservoir hosts occurs for the two trypanosome subspecies infective to man, Trypanosoma brucei rhodesiense and T. b. gambiense. Morphologically, these two subspecies are not distinguishable from a third one, T. b. brucei, which does solely infect animals. Only a partial differentiation is possible by biological, biochemical or molecular biological methods. Therefore, quick and reliable test systems are required, which identify animals as carriers of human infectious trypanosomes. In this study the PFGE karyotype patterns of 16 T. brucei reference stocks/clones (5 T. b. brucei, 9 T. b. gambiense und 2 T. b. rhodesiense), as well as 18 field isolates and 7 clones from animals and 4 field isolates from Rhodesian sleeping sickness patients were compared regarding their human serum sensitivity/resistance. The field isolates have been isolated between February 1990 and July 1992 in Bulutwe, Mukono district, south-eastern Uganda, where Rhodesian sleeping sickness is known to be endemic. The in vitro HSRT as well as the in vivo BIIT (8 selected field isolates) were used to determine the resistance of Trypanosoma brucei bloodstream forms to human serum. The reference stocks showed human serum sensitivity (T. b. brucei) or resistance (T. b. gambiense) in the HSRT as expected. Of the T. b. rhodesiense reference stocks, one was strongly resistant but the other one sensitive. However, unequivocal HSRT results of rhodesiense stocks can be explained by loss of human serum resistance after subpassaging or cultivation in absence of human serum. Of the 18 field isolates from pigs and cattle in Bulutwe, 3 were resistant, 6 subresistant and 9 sensitive in the HSRT. The 7 clones showed human serum sensitivity like their origins. Of the 5 animal isolates selected for BII-testing, 3 were resistant and 2 subresistant. These results were only partially identical with earlier BIIT-investigations, supporting the fact that T. b. rhodesiense can loose human serum resistance. The 4 stocks isolated from Rhodesian sleeping sickness patients were human serum resistant, either in the HSRT or the BIIT (3 selected ones), as expected. To figure all trypanosome chromosomes in a range from 95kbp to 3Mbp, a Biometra Rotaphor ® type V PFGE unit (Biometra, Göttingen, D) was used applying four different PFGE running conditions (0-III). Good PFGE results were achieved by using 2x10^9 trypanosomes/ml PSG buffer to prepare agarose blocks and lysing them in situ in the blocks with 1mg proteinase K/ml NDS buffer for 48h. Chromosome bands were visualized by staining with 1 µg/ml ethidium bromide (EtBr) for 30 min and destaining over night. Gels were photographed on a UV light box, the pictures edited in the documentational program BioDoc ® (Biometra, Göttingen, D) and the banding patterns analysed by ScanPack 3.0 ® cluster analysis program (Biometra, Göttingen, D). The stability and reproduceability of PFGE karyotype patterns were confirmed by analysing clones and their origins as well as bloodstream forms and procyclics or different VATs. A 100% similarity was observed. These findings implicate that trypanosomes do not change their karyotype during cyclical or variant antigen type development and that clones exhibit the same karyotype as their origin. The reference stocks and clones exhibited extremely diverse banding patterns both in terms of size and numbers of chromosome-sized DNA molecules. In the region of mini- (MC) and mega-base (MBC) chromosomes all reference stocks displayed almost the same number of bands (4-7 MC, 4-6 MBC). Only the number of intermediate chromosomes (IC) varied, with T. b. gambiense showing less (0-4 IC) than non-gambiense stocks (3-6 IC). However, none of the T. brucei subspecies formed a separately clustered group within the dendrogram. The reference stocks were distributed among the different branches with low similarities between them, implicating that no subspecies differentiation is possible according to the PFGE results. The banding patterns of the Bulutwe field isolates from pigs and cattle appeared to be more homogeneous, some of them even identical, as far as analysed. They showed a higher level of similarity than the human field isolates, whose banding patterns were as different as those of the references. However, similar or identical karyotypes of different stocks could only be related to an identical isolation date or animal. The grouping of the trypanosome stocks and clones analysed (I-V) according to their PFGE banding patterns does not allow a differentiation into human serum sensitive or resistant stocks, with the exception of group IV containing only human serum resistant T. b. gambiense stocks. Additionally, no single band correlated with the human serum sensitivity/resistance of a stock could be determined. The PFGE method is easy to learn and carry out. It can specifically characterize trypanosome stocks and is able to detect even minimal changes in their genotype. Nevertheless, no differentiation into human serum sensitive or resistant trypanosome stocks, nor into the 3 subspecies was possible with respect to the karyotypes. The reason for this is the sensitivity of PFGE lying at the level of chromosome size changes and therefore being relatively low. In trypanosomes, those size changes appear very often due to spontaneous gene-rearrangements. To enlarge the sensitivity of the method, restriction enzyme digestion of chromosomes is suggested. Even more sensitive are the PCR methods, although they contain a high risk of contamination.