Der Einfluss von all-trans-Retinsäure auf die Expression von CEACAMs bei humanen Akute-Promyelozytenleukämie - und Akute-myeloische-Leukämie - Zelllinien

Abstract

Die akute myeloische Leukämie (AML) und eine ihrer Untergruppen, die akute Promyelozyten- leukämie (APL), gehören zu den erst im Erwachsenenalter auftretenden malignen Erkrankungen des Blutes. In dieser Arbeit wurden die APL-Zelllinie NB4 und die AML-Zelllinie HL-60 mit verschiedenen Therapeutika behandelt und unterschiedliche Parameter der Zelldifferenzierung und viabilität untersucht. Zur Untersuchung der Differenzierung wurde sowohl der etablierte Oberflächenmarker CD11b als auch die bisher kaum untersuchten CEACAMs1 und 6 sowie die für Granulozyten spezifischen Marker CEACAM3 und 8 analysiert. Die Ergebnisse sollten darüber Aufschluss geben, in wie weit sich das Expressionsprofil der verschiedenen CEACAMs auf differenzierten und undifferenzierten AML/APL-Zellen als prognostischer Marker für die Wirksamkeit der Differenzierungs-Therapien verwenden lässt. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass sich die Zellen der APL-Zelllinie NB4 unter dem Einfluss von Retinsäure (All-Trans Retinoic Acid, ATRA) hin zu neutrophilen Granulozyten differenzierten. Sie veränderten dabei sowohl ihrer Größe als auch ihre Granularität, ihr Proliferationsverhalten und ihre Morphologie granulozytenentsprechend. Zudem zeigten die mit ATRA differenzierten NB4-Zellen mit CD11b, CEACAM1, 3, 6 und 8 ein für Granulozyten typisches Expressionsprofil. Mittels RT-PCR wurden die Transkriptionskinetiken verschiedener CEACAMs nach ATRA-Gabe untersucht, wobei weder die Transkription noch die Proteinsynthese der verschiedenen CEACAMs zeitgleich stattfanden. Als erstes wurde CEACAM1, dann CEACAM3 und 6 und zuletzt CEACAM8 transkribiert. Das Expressionsmuster der vier CEACAM-Proteine auf der Zelloberfläche unterschied sich jedoch signifikant von der Reihenfolge des Auftretens der mRNA-Transkripte. Zuerst erschienen CEACAM3 und 6 gleichzeitig, dann folgte CEACAM 1 und als letztes wurde CEACAM8 exprimiert. Dieses Expressionsmuster der CEACAMs auf der Zelloberfläche final differenzierter NB4-Zellen entspricht dem von reifen humanen Granulozyten. Bei der Kombination von ATRA mit Curcumin und/oder GM-CSF konnten keine gesteigerten CEACAM-Expressionen oder verlängerte Überlebenszeiten der differenzierten Blasten nachgewiesen werden. Bei der Kombination von ATRA und GM-CSF differenzierten sich die NB4-Zellen teilweise zu Makrophagen, was für die ATRA-Therapie, bei welcher eine große Anzahl toter Leukämie-Zellen anfällt, von Bedeutung sein könnte. Neben dem Oberflächenexpressionsmuster der verschiedenen CEACAMs wurden auch die molekulare Größe und die CEACAM1-Isoformen analysiert. Bekanntermaßen ist ein Großteil des Molekulargewichtes der verschiedenen CEACAMs auf ihre sehr starke Glykosylierung zurückzuführen. Diese Glykosylierung ist heterogen und variiert gerade bei CEACAM1 von Zelltyp zu Zelltyp. So zeigen humane Granulozyten eine deutlich höhere Glykosylierung (160 kD) als z.B. Epithelzellen mit (120 kD). Wir konnten nun zeigen, dass die molekulare Größe von CEACAM1 auf differenzierten NB4-Zellen nahe zu dem von humanen Granulozyten entsprach. Bei der Stimulierung der ATRA-behandelten NB4-Zellen mit fMLP kam es darüber hinaus zu einer schnellen Erhöhung der Oberflächenexpression von CEACAM1 und 6, was bedeutet, dass die differenzierten Zellen genau wie Granulozyten die Fähigkeit zur Degranulation besitzen. Eine weitere Besonderheit humaner Granulozyten ist, dass sie ausschließlich die langen Isoformen von CEACAM1 exprimieren. Wir fanden, dass dieses Merkmal auch für die final differenzierten NB4-Zellen zutraf. Werden HL-60-Zellen mit ATRA behandelt, so differenzieren sie im Gegensatz zu den NB4-Zellen nicht. Wird jedoch eine Kombination aus ATRA und DMSO verwendet, so kommt es zur Expression von CEACAM1. CEACAM6 konnte nicht nachgewiesen werden. Andere CEACAMs auf HL-60-Zellen wurden im Rahmen dieser Arbeit nicht getestet. Für Arsentrioxid konnte gezeigt werden, dass es weder auf NB4 noch auf HL-60-Zellen eine Oberflächenexpression von CEACAMs induziert. Es war jedoch dazu in der Lage, die beiden Zelltypen in Apoptose zu treiben.

The acute myeloid leukemia (AML) and one of its subgroups, the acute promyelocytic leukemia (APL) belong to the malignant diseases of the blood of the adulthood. Traditional approaches for treatment of leukemia involve chemotherapy, radiation and bone marrow transplantation. For APL, which presents 10-15% of all AML-cases, exists a specific targeted therapie with All-trans retinoic acid (ATRA). The treatment with ATRA leads to a complete remission in patients suffering of APL, though it has to be combined with chemotherapy, because otherwise a relapse occurred. Furthermore, it is known to induce the differentiation of the malignant cells into granulocytes. We treated the APL-cell-line NB4 and the AML-cell-line HL-60 with different therapeutics including ATRA alone and combinations of ATRA with GM-CSF, curcumin and arsenic trioxide in order to investigate the change of the expression and the level of cell differentiation. As expected, ATRA inhibited cell proliferation, induced apoptosis and triggered the expression of granulocyte-specific cell surface markers such as CD11b and the CEACAMs 1, 3, 6 and 8. Interestingly, the induction of the CEACAMs, which belong to the Ig superfamily of cellular surface molecules, did not appear simultaneously but separately. ATRA induced the expression of CEACAM3 and 6 on day 1-2, CEACAM1 (the long isoforms) on day 3-4 and CEACAM8 on day 5 just before the cells went into apoptosis. In addition to that, fMLP was able to induce degranulation of CD11b and CEACAM 1 and 6 in ATRA-differentiated NB4. ATRA in combination with the other agents had only marginal synergistic effects. HL-60 treated with ATRA alone did not differentiate, but in combination with DMSO, CEACAM 1 and CD11b were expressed.