Transkingdom RNAi: Modulation der klassischen und atypischen Multidrugresistenz mittels bakteriell übertragener RNAi Effektoren

Abstract

RNA Interferenz (RNAi) ist ein hoch effektiver, zellulärer Mechanismus eukaryotischer Organismen zur spezifischen Inhibition der Genexpression. Der therapeutische Einsatz des posttranskriptionellen Phänomens zur Behebung genetischer Dysregulationen scheitert bislang vor allem an der Identifizierung effizienter Methoden zur Übermittlung (Delivery) der RNAi initiierenden Nukleinsäuren (RNAi Effektoren) in Zielzellen. Eine vielversprechende Delivery-Methode stellt die von Xiang et al. (2006) entwickelte transkingdom RNAi (tkRNAi) dar. Das hierbei verwendete tkRNAi Plasmid (TRIP), das Invasin (inv), Listeriolysin O (hlyA) und eine sh(short hairpin)RNA- Expressionskassette nach Wahl kodiert, ermöglicht nicht-pathogenen E. coli in Mammaliazellen einzudringen und die intrabakteriell exprimierten shRNAs, nach bakterieller Lyse, in das Zielzellzytoplasma zu übermitteln. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde das therapeutische Potential der tkRNAi-TRIP Variante und der modifizierten Variante tkRNAi-pMBV43 am Beispiel der klinisch relevanten ABCB1 assoziierten klassischen und der ABCG2 assoziierten atypischen Multidrugresistenz (MDR) untersucht, an denen chemotherapeutische Krebstherapien häufig scheitern. Als Modelle dienten gut etablierte humane MDR Zelllinien. Invasion und Lyse der TRIP bzw. pMBV43 enthaltenden Bakterien, sowie die erfolgreiche Übermittlung der entsprechenden shRNAs in die Zielzellen konnten nach Infektion in allen Zelllinien bestätigt werden. Die tkRNAi-TRIP anti-ABCB1 bewirkte eine spezifische ABCB1 Repression und eine partielle Reversion des klassischen MDR Phänotyps um 59,9 %. Im gleichen MDR Modell (EPG85-257RDB) wies die tkRNAi-pMBV43 anti-ABCB1 eine 30 % stärkere MDR Reversion von 88,5 % auf, die in einem weiteren MDR Modell (MaTu/ADR) mit 89,5 % ähnlich deutlich ausfiel, jedoch zeitlich stark verzögert auftrat. Weiterhin resultierte die tkRNAi-pMBV43 anti-ABCG2 Behandlung der ABCG2 überexprimierenden, atypischen MDR Zelllinie (EPG85-257RNOV) in einer deutlich reduzierten ABCG2 Expression und einer partiellen Reversion der atypischen MDR um 53,5 %. Die in vitro Ergebnisse verdeutlichen die Effektivität und die Effizienz der tkRNAi, insbesondere der tkRNAi-pMBV43 Variante, bezüglich des RNAi Effektoren Deliverys. Einhergehend stellt das Potential der tkRNAi eine vielversprechende Chance dar, multidrugresistente Tumorzellen in in vivo Modellen und in letzter Konsequenz in künftigen klinischen Studien zu resensitivieren und somit eine chemotherapeutische Behandlung zu ermöglichen.

RNA interference (RNAi) is a highly effective cellular mechanism of eucaryotic organisms that specifically inhibits gene expression. A major obstacle for the therapeutic application of this post transcriptional phenomenon, with the aim to overcome genetic dysregulations, is the absence of efficient methods for delivering the RNAi initiating nucleic acids (RNAi effectors) into target cells. The transkingdom RNAi (tkRNAi) technololgy, developed by Xiang et al. (2006), represents a promising approach to overcome this obstacle. The tkRNAi plasmid (TRIP), encoding invasin (inv), listeriolysin O (hlyA), and a sh(short hairpin)RNA expression cassette, allows non-pathogenic E. coli to enter mammalian cells. The release of the intra-bacterially expressed shRNAs of interest into the target cells’ cytoplasm takes place after bacterial lysis. In the course of the presented study the tkRNAi variant tkRNAi-TRIP and the modified variant tkRNAi-pMBV43 were tested with respect to their therapeutic potential in the context of the clinically relevant classical ABCB1-mediated, and atypical ABCG2-mediated depending multidrug resistance (MDR), which often cause failure of chemotherapy. Different classical and atypical MDR cell lines served as models. Invasion and lysis of bacteria containing TRIP or pMBV43 respectively as well as the successful delivery of the according shRNAs into the target cells had been observed in each cell line after infection. TkRNAi- TRIP anti-ABCB1 caused a specific repression of ABCB1 and a partial reversion of the classical MDR phenotype by 59.9 %. In the same MDR cell line (EPG85-257RDB) tkRNAi-pMBV43 anti-ABCB1 induced a 30 % stronger reversion of the MDR phenotype (88.5 %). The efficacy of the tkRNAi-pMBV43 variant was confirmed in a second classical MDR cell line (MaTu/ADR), which showed an equally strong, although in comparison to EPG85-257RDB cells largely delayed, reversion of the classical MDR phenotype by 89.5 %. Furthermore treatment of an ABCG2 overexpressing atypical MDR cell line with tkRNAi-pMBV43 anti-ABCG2 resulted in a significantly reduced ABCG2 expression and a partial reversion of the atypical MDR by 53.5 %. These results illustrate that the tkRNAi technology, especially the tkRNAi-pMBV43 variant, is highly effective in terms of RNAi effector delivery. Hence tkRNAi represents a powerful opportunity to re-sensitize MDR tumor cells and to eliminate them by simultaneous chemotherapeutic treatment in vivo, and consequently also in clinical trials.