Identification and characterization of potential target genes of the histone demethylase PTDSR/JMJD6

Abstract

Epigenetic regulation has become a domain of growing interest especially in cancer research and other fields for the past years due to evolving knowledge and better research techniques in this field. Covalent modifications on histones play a fundamental role in the regulation of chromatin dynamics and function as being part of transcriptional activation or repression. One of the many post-translational modifications taking place in the genome is histone methylation, which has been shown to play a critical role in gene transcription. Not until recently, the enzymes capable of removing these methylation marks, either on histones or non-histones, were identified. LSD1 was the founding member of demethylases, which directly reverses histone H3K4 or H3K9 modifications by an oxidative demethylation reaction in which flavin is a cofactor. In addition, the largest classes of demethylases enzymes, which contain a Jumonji C (JmjC) domain have been identified. While LSD1 can only remove mono- and dimethyl lysine modifications, the JmjC-domain-containing histone demethylases (JHDMs) are capable of reversing all three histone lysine methylation states. Experiments carried out on JMJD6 (PTDSR) “knock-out” mice indicated that PTDSR plays an important role in tissue differentiation during embryogenesis. Delays and defects in terminal differentiation of the kidney, intestine, liver and lung during embryogenesis, brain malformation (midbrain, brainstem cord junction, and cerebellum) or bilateral absence of eyes among others were detected in the homozygote JMJD6-/- mice (Fig.04). The major aim of this project was to identify possible biological targets for the JmjC- domain containing enzyme PTDSR. The focus was set on the possibility of Hox genes being biological targets for PTDSR, because they encode for proteins regulating important transcription factors, greatly affecting epigenetic regulation and development during embryogenesis. Also, selected neural genes were examined in this study as potential PTDSR targets. Indeed, the experiments indicated that under RA stimulation, many of the Hox genes required PTDSR for their full activation. In contrast, some showed impaired activation or even repression when knocking down PTDSR (Fig.16). Interestingly, all the neural genes we examined required PTDSR for their full neuronal differentiation by RA. Furthermore, PTDSR seemed to regulate many of these genes through directly binding to the promoter regions as revealed by ChIP assays, possibly through demethylating a potentially repressive histone marker, H1K26me3. Further investigations in this field will give a more detailed insight into whether this enzyme possibly also demethylates other non-histone substrates or if it might work through complex activation in regulating gene transcription.

Unter epigenetischer Regulation versteht man unterschiedliche molekulare Mechanismen, die ohne Veränderung der DNA-Nukleotidsequenz die Expression verschiedener Gene regulieren können und vererblich sind. Durch ein tieferes Verständnis und verfeinerte Forschungstechniken wird das Feld der epigenetischen Regulation für die Entwicklungsbiologie und die Krebsforschung immer wichtiger. Die Gentranskription wird neben anderen Mechanismen besonders auch durch Modifikationen an Histonen, z.B. eine Histonmethylierung, gesteuert. Eine der zuerst studierten Demethylasen, die Methylierungsmarker von Histonen entfernen können, LSD1, demethyliert oxidativ die Histone H3K4 und H3K9 am Lysin. Zusätzlich wurde eine große Klasse von Demethylasen charakterisiert, die eine Jumonji C Domäne (JmjC) enthalten und ebenfalls Lysinreste demethylieren kann. Während LSD1 nur Mono- oder Dimethyl-Lysine demethylieren kann, sind die JmjCs in der Lage alle drei Methylierungsstellen der Lysine revertieren. Experimente mit knock-out Mäusen hatten gezeigt, dass lebenswichtige Gewebedifferenzierungsschritte in unterschiedlichen Organen (Niere, Darm, Leber, Lunge, Gehirn und Auge) durch die JmjC enthaltenden Demethylase JMJD6 (PTDSR) gesteuert werden. In der vorliegenden Arbeit wurden potentielle Target-Gene der Demethylase JMJD6/PTDSR identifiziert. Der spezifische Fokus wurde nach der Microarray Analyse auf die Gruppe der HOX Gene gelegt, welche sich durch PTDSR deutlich regulierbar zeigten. Als Hauptziel dieser Arbeit wurde daher untersucht, ob HOX-Gene und einige neurale Gene Zielstrukturen von PTDSR enthalten, da diese wichtige Transkriptionsfaktor-regulierende Gene repräsentieren und so die epigenetische Genregulation während der Embryogenese steuern. Die Experimente dieser Arbeit konnten zeigen, dass viele HOX-Gene, unter Stimulation mit Retiniolsäure (RA), PTSDR zur vollen Aktivität benötigen und unter knock-down Bedingungen für PTSDR funktionell inaktiv sind. Ebenso benötigen alle untersuchten neuralen Gene PTSDR zu ihrer Aktivierung durch RA. ChIP Assays zeigten, dass PTSDR bei seiner regulativen Aktivität direkt an Promotorregionen dieser Gene gebunden ist und einen potentiell repressiven Histonemarker, H1K26me3 demethyliert. Diese Experimente sind für das molekulare Verständnis der Organentwicklung in der Embryogenese von wesentlicher Bedeutung. Weitere Experimente werden zeigen ob PTSDR auch andere Non-Histon Substrate demethyliert oder ob komplexere Regulationsmechanismen der Gentranskription greifen.