Taking a Functional Genomic Approach to the Study of Down Syndrome Pathogenesis

Abstract

Down syndrome (DS) or trisomy 21 is a complex congenital disorder affecting 1:700 live births, and a leading genetic cause of mental retardation. The identification of genes and molecular mechanisms responsible for the DS phenotypes has therefore been a high priority for genome research. Using Ts65Dn, a well-established mouse model of DS, we carried out gene expression profiling by cDNA arrays and quantitative Real Time PCR (qPCR). We focused on the chromosome 21 genes orthologs (mmu21) because they are primary contributors of trisomy. We analyzed RNAs from several tissues of Ts65Dn and controls, either as pools or as individual samples. With pools, we observed a trend of 1.5 fold overexpression for the majority of trisomic genes with however exceptions to this rule for a few genes (Kahlem, Sultan et al., 2004). For many genes, it is unlikely that such a modest change in gene expression levels will have drastic effects on the fitness of the organism. To select genes, where slight changes in gene activity could have a more dramatic phenotypic effect, we focused on the normal variation of gene expression levels. Genes whose level of gene expression is critical are more likely to be tightly controlled than those for which slight variation of expression will not have a detrimental effect. Our working hypothesis is that genes relevant for DS reach an expression threshold in trisomic individuals that is not or rarely encountered in controls. Hence, we determined inter-individual expression differences for 50 chr21 gene orthologs in the cortex, midbrain and cerebellum of individual Ts65Dn mice and controls by qPCR (TaqMan). Our study enabled the identification of a short list of potential key contributor genes of the trisomy phenotypes in the brain. Among those, we found App, the amyloid precursor protein (sultan et al., submitted). Although the systematic analysis of mmu21 gene expression profiles contributes to an understanding of how cells and organisms respond to structural gene dosage imbalance, it does not give direct information on gene function. Systematic functional genomic approaches are being carried out in parallel in the laboratory. As part of this, we attempted to contribute a functional analysis study in Caenorhabditis elegans for nine selected genes. We monitored tissue specific expression GFP fusions under the control of the respective endogenous promoters. The selected genes were knocked-down by means of RNA interference (RNAi). The use of C. elegans provides an excellent experimental model for the initial characterization of gene function and may become an important tool in assessing the contribution of genes in complex phenotypes such as DS.

Down-Syndrom (DS) oder Trisomie 21 ist eine komplexe angeborene Krankheit, die eine aus 700 Lebendgeburten betrifft und welche die weitverbreitetste genetische Ursache geistiger Behinderung darstellt. Daher ist die Erkennung der für die DS-Phänotypen verantwortlichen Gene und molekularen Mechanismen von höchster Priorität für die Humangenomforschung. Unter Verwendung von Ts65Dn, einem etablierten Mausmodell für DS, wurden Genexpressionsprofile mittels cDNA-Chips und quantitativer Real Time-PCR (qPCR) erstellt. Unser Hauptaugenmerk richtete sich dabei auf die Orthologen der Chromosom-21-Gene (mmu21), welche als die primären Auslöser des Down-Syndroms gelten. Aus mehreren Ts65Dn-Geweben und Kontrollmäusen wurde jeweils RNA in Pools und Individualproben isoliert. Bei den Pools beobachteten wir für die Mehrzahl der Gene eine Tendenz zu 1,5-facher Überexpression unter Ausnahme einiger weniger Gene (Kahlem, Sultan et al., 2004). Für viele Gene jedoch erscheint es unwahrscheinlich, dass bei einer solch geringfügigen Veränderung des Genexpressionsniveaus drastische Auswirkungen auf die Gesundheit des Organismus entstehen. Bei der Auswahl von Genen, die durch geringfügige Veränderungen des Expressionsniveaus einen Phänotyp verursachen könnten, konzentrierten wir uns auf die Analyse der natürlichen Expressionsvarianz. Gene mit kritischem Expressionsniveau unterliegen tendenziell erhöhter Kontrolle als solche, bei denen eine minimale Expressionsveränderung keine nachteilige Auswirkung zur Folge hätte. Unsere Arbeitshypothese ist, dass die für die DS-Forschung relevanten Gene in Trisomie-Fällen eine Expressionsschwelle überschreiten, die nicht oder nur selten in Kontrollfällen erreicht wird. So stellten wir interindividuelle Expressionsunterschiede bei 50 chr.21-Orthologen im Kortex, Mittelhirn und Cerebellum der individuellen Ts65Dn-Mäuse und Kontrollmäuse durch qPCR (TaqMan) fest. Anhand unserer Untersuchung konnten wir eine Liste potentieller Auslösergene der Trisomie- Phänotypen im Gehirn erstellen. Unter ihnen befand sich zum Beispiel das Amyloid Precursor Protein (APP) (Sultan et al., eingereicht). Obwohl die systematische Analyse von mmu21-Genexpressionsprofilen dazu beiträgt zu erkennen, wie Zellen und Organismen auf eine strukturelle Störung der genetischen Dosis reagieren, erlaubt sie keine direkte Schlussfolgerungen auf Genfunktionen. Daher wurden parallel systematische funktionelle Versuche durchgeführt. Hierzu wählten wir neun Kandidatengene aus, um zu versuchen deren Orthologe im Modellorganismus Caenorhabditis elegans zu analysieren. Wir untersuchten die gewebespezifische Expression von GFP-Reportern unter Kontrolle der entsprechenden endogenen Promotoren. Weiterhin wurden die ausgewählten Gene mittels RNA-Interferenz (RNAi) reprimiert. C. elegans stellt ein ausgezeichnetes Modell zur Initialcharakterisierung von Genfunktionen dar und scheint dazu geeignet, ein wichtiges Hilfsmittel zur Bewertung des Beitrages einzelner Gene zu komplexen Phänotypen wie DS zu werden.