Einfluss von GABA-Rezeptor-Antagonisten auf die hippocampale Neurogenese im sich entwickelnden Gehirn der Ratte

Abstract

In das letzte Trimenon der Schwangerschaft fallen vulnerable Schritte der neuronalen Entwicklung. Frühgeborene kommen in dieser Phase mit exogenen und teilweise toxischen Einflüssen in Berührung. Der Neurotransmitter Gamma-Aminobuttersäure (GABA) wechselt während der Zeit des schnellsten Hirnwachstums seine Funktion vom depolarisierenden zum zunehmend hyperpolarisierenden Neurotransmitter. Störungen der GABAergen Transmission, während dieses „GABAergic shifts“, wurden in Verbindung gebracht mit im späteren Leben Frühgeborener gehäuft auftretenden neurologischen und psychiatrischen Erkrankungen. Diese in-vivo-Studie untersucht Auswirkungen einer temporären GABARezeptorblockade auf die Neurogenese im Gyrus dentatus (DG) des sich entwickelnden Hippocampus. Neugeborenen Wistar-Ratten wurde ab dem sechsten bis zum 11. Lebenstag (P6-P11) täglich der reverse GABAA-Rezeptoragonist DMCM, der GABABRezeptorantagonist CGP 35348 oder NaCl 0,9% als Kontrollsubstanz intraperitoneal appliziert. Nach Tötung zum Zeitpunkt P11 wurden mittels immunhistochemischer Färbung neuronale Vorläuferzellen, mitotische und postmitotische Neurone untersucht. Postmitotische Neurone wurden zusätzlich zum Zeitpunkt P15 quantifiziert. Mittels quantitativer PCR wurde die Expression neuronaler Transkriptionsfaktoren, Neurotrophine sowie Mediatoren für Apoptose und oxidativen Stress analysiert. Die immunhistochemische Analyse zeigte nach GABAB-Rezeptorblockade eine deutliche Reduktion der NeuroD1-positiven intermediären Vorläuferzellen, sowie proliferierender Nestin-positiver neuronaler Vorläuferzellen. Assoziiert dazu wurden Marker dieser Entwicklungsstufen der neuronalen Differenzierung, wie die Transkriptionsfaktoren Pax6, Ascl1 und NeuroD1, signifikant vermindert exprimiert. Eine GABAA-Rezeptorblockade führte zu keinen Veränderungen auf zellulärer Ebene. Postmitotische NeuN-positive Neurone waren zu den Zeitpunkten P11 und P15 unbeeinflusst. Allerdings zeigte die Expressionsanalyse an P11 nach GABAB-Rezeptorblockade eine Verminderung spezifischer Marker postmitotischer Neurone, wie Tbr1, Prox1 und NeuroD2, als auch von Neutrophinen. Die Analyse der pro-inflammatorischen Zytokinantwort zeigte eine Induktion von TNFα nach Applikation sowohl GABAA- als auch GABABRezeptorantagonisten. Erhöhte neurodegenerative Effekte waren nicht nachweisbar. Die Blockade von GABAB-Rezeptoren zur Zeit des schnellsten Hirnwachstums beeinflusste somit wesentlich die hippocampale Differenzierung neuronaler Zellen im Gehirn der neugeborenen Ratte und lässt auf eine Vulnerabilität der hippocampalen Neurogenese für postnatale Störungen in der GABAergen Transmission insbesondere über den metabotropen Rezeptor schließen. In der Forschung und Klinik sollten zukünftig bei pharmakologischen Interventionen an metabotropen GABA-Rezeptoren mögliche negative Einflüsse auf die neurologische Entwicklung Frühgeborener berücksichtigt werden.

The last trimenon of human pregnancy contains critical steps of neurological development. During this vulnerable phase, premature children are exposed to exogen influences and possibly also disturbances in GABAergic transmission. The neurotransmitter GABA changes its main function during the rapid brain growth spurt. While it functions as a depolarizing neurotransmitter pre- and perinatally, GABA increasingly evolves a hyperpolarizing character postnatally. Disturbances in this socalled “GABAergic shift” have been implicated to play a role in the pathogenesis of several neurological and psychiatric disorders that are more prevalent in the later lives of preterm born children. This in-vivo study in newborn Wistar rats investigates consequences of a temporary pharmacological blockade of GABA-receptors on the ongoing neurogenesis in the hippocampal dentate gyrus (DG). Newborn rats were intraperitonially injected with either a reverse GABAA-receptor agonist (DMCM), a GABAB-receptor antagonist (CGP 35348) or solely NaCl in the control group on six consecutive days, from postnatal day P6 to P11. Immunohistochemical analysis on P11 revealed a clear reduction of NeuroD1-positive intermediate progenitor cells and actively proliferating Nestin-positive neural stem cells after application of GABAB-receptor antagonists. Quantitative PCR supported this by finding reduced expressions of markers for these stages in neuronal differentiation, the transcription factors Pax6, Ascl1 and NeuroD1. Application of GABAA-receptor antagonists did not cause significant changes detected in immunohistochemical analysis. There were no changes in the number of postmitotic NeuN-positive cells after application of the GABA-receptor antagonist at P11 and P15. Nevertheless, we found significantly reduced expressions of Tbr1, Prox1 and NeuroD2 in CGP-treated animals, so specific markers for postmitotic neurons were affected at a subcellular level. Furthermore, expressions of all tested neurotrophins decreased after GABAB-receptor blockade. Analysis of pro-inflammatory cytokines showed the induction of TNFα expression after application of GABA-receptor antagonists. There were no neurodegenerative effects detectable. This in-vivo study indicates that GABAergic transmission via the metabotropic GABABreceptor inhibits a critical role in differentiation of neural cells in the hippocampus of neonatal rats. Data of our study show the vulnerability of hippocampal neurogenesis at the time of rapid brain growth spurt. Future research on pharmacological interventions, acting on metabotropic GABA-receptors, should therefor consider a possible negative impact on neurological development in preterm born infants.