Identifikation von wichtigen Transkriptionsfaktoren bei der Differenzierung von T-Helferzellen mittels integrativer Netzwerkanalysen: Der Transkriptionsfaktor IRF8 ist ein Regulator der Th1 und Treg Differenzierung

Abstract

Datenintegration in Form von integrativen Netzwerkanalysen wurde in den letzten Jahren erfolgreich für die Beschreibung von neuen molekularbiologischen Zusammenhängen in biologischen Netzwerken eingesetzt. In dieser Arbeit diente die integrative Netzwerkanalyse als nützliches Werkzeug für die Beschreibung der Differenzierungsprozesse von T-Helfer (Th) -zellen. Diese spielen eine wichtige Rolle in der adaptiven Immunantwort, sowie in der Pathogenese von chronisch infektiösen, allergischen und autoimmunen Erkrankungen. Die Identifikation von potenziell richtungsweisenden Transkriptionsfaktoren in der Differenzierung von T-Helferzellen war ein vorrangiges Ziel dieser Arbeit. Hierfür wurden zunächst globale Transkriptom- Analysen von T-Helferzellen vorgenommen und Subtyp-spezifisch exprimierte Transkriptionsfaktoren identifiziert. Hierzu zählen u. a. Irf8 und Etv6 in Th1, Npas2 und Asb2 in Th2 sowie Irf8 und Dbp in induzierten regulatorischen T (iTreg) -Zellen. Zur Unterstützung der Auswahl an potenziellen Transkriptionsfaktoren wurde im zweiten Schritt eine integrative Netzwerkanalyse durchgeführt. Hierfür wurden verfügbare globale RNA-Seq Daten von Stat4 bzw. Stat6 Knockout Mausstudien sowie STAT4 bzw. STAT6 ChIP-Seq Daten mit dem generierten RNA-Seq Datensatz der T-Helferzellen integriert. Diese integrierten Daten wurden darüber hinaus in einem transkriptionellen Netzwerk um den Transkriptionsfaktor STAT4 für Th1 bzw. STAT6 für Th2 Zellen visualisiert. Es wurde gezeigt, dass dieses Vorgehen der Datenintegration ein nützliches Werkzeug zur Beschreibung von Differenzierungsprozessen in T-Helferzellen ist. Des Weiteren validierte die integrative Netzwerkanalyse IRF8 als potenziellen Weichensteller in der Th1 Differenzierung. So wurde gezeigt, dass STAT4 und STAT6 direkt an das Gen von Irf8 binden und dessen Expression beeinflussen. Während STAT4 die Expression von Irf8 induziert, wird sie durch STAT6 supprimiert. Zusätzlich wurde in den Th1 Zellen eine potenzielle Gen-Gen-Interaktion von Irf8 mit dem Th1-spezifischen Zytokin Ifng gefunden. Die funktionelle Charakterisierung von IRF8 in der Differenzierung von T-Helferzellen war ein weiteres Ziel dieser Arbeit. Es konnte gezeigt werden, dass die Expression von Irf8 durch den T-Zellrezeptor Signalweg induziert und vermutlich Subtyp-spezifisch in Th1 und iTreg Zellen über die IFNγ/STAT1-, IL12/STAT4-, TGFβ/SMAD3- und IL2/STAT5-Signalwege verstärkt wird. Des Weiteren wiesen Irf8 -/- Mäuse eine verringerte Frequenz an Th1-spezifischen Gedächtnis-T-Zellen (TBET+IFNγ+) und natürlichen regulatorischen T (nTreg) -Zellen auf. In vitro hingegen begünstigte ein IRF8-Defizit die Entstehung von TBET-, IFNγ- und GM-CSF-produzierenden Th1 sowie FOXP3-produzierenden iTreg Zellen. Zusätzlich führte ein IRF8-Defizit in polarisierten iTreg Zellen zur Erhöhung der Pro-teinmenge der am TGFβ- Signalweg beteiligten Mediatoren TGFβR2 und SMAD2/3. Die in vitro Beobachtungen in den IRF8-defizienten Zellen wurden mit adenoviraler Überexpression und shRNA-Knockdown von Irf8 validiert. Anhand dieser und publizierter Ergebnisse wurde erörtert, dass IRF8 als extrinsischer Aktivator über die Modulation der Funktion von APCs agiert und die Th1- sowie Treg- Immunantwort fördert. Intrinsisch hingegen wirkt IRF8 als Gegenspieler und kontrolliert die Immunantwort der Th1 Zellen über die TBET Proteinmenge, sowie die der iTreg Zellen über den TGFβ-Signalweg. Somit ist IRF8 in den T-Zellen für eine moderate IFNγ- sowie FOXP3-Produktion essentiell und verhindert eine überschießende Immunantwort. Die Ergebnisse in dieser Arbeit belegen, dass IRF8 ein wichtiger Regulator der T-Zelldifferenzierung ist und als potenzielles Zielgen in der Entwick-lung von neuen Therapieansätzen für T -Zell-spezifische Erkrankungen fungieren könnte.

Within the past years data integration in terms of integrative network analysis was successfully used to describe new interrelations within biological networks on a molecular level. In this thesis the integrative network analysis was used as a tool to describe T helper (Th) cell fate decisions. T helper cells play a major role in the adaptive immune response as well as in the pathogenesis of chronic infectious, allergic and autoimmune diseases. The identification of important regulatory hubs in T helper cell fate decisions was a primary goal of this thesis. To identify subtype- specifically expressed transcription factors a global gene expression analysis of T helper cells was conducted. Among these are Irf8 and Etv6 in Th1, Npas2 and Asb2 in Th2 as well as Irf8 and Dbp in induced regulatory T (iTreg) cells. To support this selection of potential transcription factors as a second step an integrative network analysis was conducted. Therefore available global RNA- seq data of Stat4 and Stat6 knockout mice studies as well as STAT4 and STAT6 ChIP-seq data was integrated with the generated RNA-seq data set of T helper cells. In addition these integrated data were visualized in a gene regulatory network around the transcription factor STAT4 for Th1 and STAT6 for Th2 cells. It was shown that this approach of data integration is a useful tool for describing differentiation processes of T helper cells. Further the integrative network analysis validated IRF8 as a potential regulatory hub in Th1 cell differentiation. Thus it was shown that STAT4 and STAT6 directly bind to the gene of Irf8 and influence its expression. While STAT4 induces the expression of Irf8, STAT6 suppresses the expression of Irf8. Also a potential gene-gene interaction of Irf8 and the Th1 specific cytokine Ifng was found in Th1 cells. The functional characterization of IRF8 in T helper cell differentiation was a further goal of this thesis. It was shown that the expression of Irf8 is induced by the T cell receptor signaling and presumably subtype-specifically enhanced by IFNγ/STAT1-, IL12/STAT4-, TGFβ/SMAD3- and IL2/STAT5-signaling in Th1 and Treg cells. Moreover Irf8 -/- mice showed a decreased frequency in Th1 specific memory T cells (TBET+IFNγ+) and natural regulatory T (nTreg) cells. In vitro on the other hand an IRF8 deficit promoted the occurrence of TBET-, IFNγ- and GM-CSF-producing Th1 cells as well as FOXP3-producing iTreg cells. Further an IRF8 deficit in polarized iTreg cells resulted in an increased protein level of TGFβR2 and SMAD2/3 which serve as mediators in the TGFβ signaling pathway. These in vitro observations in IRF8 deficient cells were validated by adenoviral overexpression and shRNA knockdown of Irf8. Based on these and previously published results IRF8 was discussed as an extrinsic activator that promotes the Th1 and Treg immune response by modulating the function of APCs. Intrinsic IRF8 acts as an antagonist and controls the Th1 immune response by decreasing the TBET protein level as well as the Treg immune response by suppressing the TGFβ signaling pathway. Therefore IRF8 is essential for a moderate IFNγ and FOXP3 production in T cells and prevents an excessive immune response. The results of this thesis prove that IRF8 acts as a potential regulator in T helper cell differentiation. Thus IRF8 can serves as a potential target in the development of novel therapeutic approaches for T cell specific diseases.