Untersuchungen zu Proteinaggregationsprozessen mittels dynamischer und elektrophoretischer Lichtstreuung

Abstract

Die Bestimmung der 3-dimensionalen Struktur von Proteinen durch Röntgendiffraktion setzt Einkristalle voraus. Die Herstellung dieser Einkristalle stellt eines der größten Probleme der Proteinstrukturaufklärung dar. Der Kristallisationsübergang ist bei Proteinen durch Theorien nur ungenügend beschrieben und durch empirische Ergebnisse geringfügig ergänzt. Die vorliegende Arbeit liefert einen Beitrag zum Verständnis der Proteinwechselwirkungen in Elektrolytlösungen, speziell beim Standardprotein Lysozym. Hierzu dienten die Photonen-Korrelations-Spektroskopie und die Laser- Doppler-Anemometrie. Die erste Methode führt über die Diffusionsmessungen zur Angabe der Radien- und Teilchenzahlverteilungen in den Proteinlösungen und die zweite über Mobilitätsmessungen zum Zetapotential und zur Teilchenladung der untersuchten Proteine. Beide Messverfahren, u.a. teils an Tropfen von 10μl durchgeführt, geben Einblicke in die Startphase der Aggregation sowie in die Aggregationskinetik, die teilweise direkt mit dem Erfolg der Kristallisation korreliert werden können. Die grundsätzliche Übereinstimmung der gemessenen Daten mit den Endzuständen der Proteine in Form von Kristallen oder amorphen Präzipitats ist bestätigt, aber eine sichere Aussage über den Ausgang einer Proteinkristallisation ist nur tendenziell möglich. Dennoch kann die zusätzlich erhaltene Information mittels Lichtstreuung den Aufwand für eine erfolgreiche Kristallisation erheblich reduzieren. Daher liegen die Anwendungsmöglichkeiten in der besseren Voraussage der Kristallisationsbedingungen von Proteinen und in der effektiveren Verwendung innerhalb einer Automatisierung der Proteinkristallisation.

The elucidation of the 3-dimensional structures of proteins needs crystals suitable for X-ray analysis. An absolute prerequisite for any crystallographic analysis is that well-ordered single crystals of the proteins are obtained. Unfortunately, the crystallisation of proteins and their complexes is still more of an art than a science and represents the major bottleneck in the determination of the 3d-structures by X-ray analysis. The present investigations provide an insight into molecular interactions, optimal crystallisation conditions and enhanced and novel crystallisation kits. For this photon-correlation-spectroscopy and laser-doppler-velocimetry were utilized. The former method provides essential information on the diffusion coefficient and hence on the radius and particle size distribution in the protein solutions. The latter method determines the zeta potential and the surface net charge of a protein via the measured electrophoretic mobility. Both measuring systems, also used in hanging drops with volumes of 10μl, provided a better understanding in aggregation phenomena, which could be partly correlated with optimal crystallisation conditions. The funfamental coincidence of the measured data with the aggregation state of the proteins in form of crystals or amorphous precipitate is confirmed, but a sure prediction between the outcome and the conditions of a protein crystallisation is only tendentiously possible. Nevertheless it is feasible to reduce the expense for a successful crystallisation by achieving additional information by means of light scattering techniques. The usefulness lies in the ability of getting a rational protocol of protein crystallisation and in the facilitation of protein crystallisation diagnostics.