Entwicklung eines Selektionsschemas zur Isolierung katalytischer Ribonucleinsaeuren und eines dynamischen Verfahrens zur Bestimmung von Konzentrationen kleiner organischer Molekuele

Abstract

Zusammenfassung Die katalytische Aktivität von Ribonucleinsäuren ist von großer Bedeutung für mögliche präbiotische Prozesse. Dabei wird die Bildung von C-N-Bindungen als essentieller Bestandteil im Metabolismus einer hypothetischen RNA-Welt angesehen. Diese Arbeit beschreibt die Entwicklung eines Selektionsschemas zur Isolierung neuer Ribozyme, welche die N-glycosidische Bindungsknüpfung zwischen PRPP und einer Nucleobase katalysieren sollen, sowie der dafür benötigten Technologien. Diese katalytische RNA sollte aus einer kombinatorischen RNA-Bibliothek mit Hilfe der in vitro Selektionstechnik isoliert werden. Es wurde dazu das Prinzip der direkten Selektion erweitert zur "direkten Selektion mit linkergekoppelten Reaktanden". Dieses neue Selektionsschema erfordert die ortsspezifische Einführung eines der beiden Reaktionspartner über einen Linker an sämtliche RNA-Moleküle der RNA-Bibliothek. Zu diesem Zweck wurde eine Methode zur enzymatischen 3'-Modifizierung von RNA entwickelt, die auf der Einführung von synthetischen Linkern durch die T4-RNA-Ligase beruht. So konnten Nicotinsäure und Uracil-6-carbonsäure über Polyethylenglycol als flexiblen Linker direkt und spezifisch an den 3'-Terminus der RNA gebunden werden. Diejenigen RNA- Konjugate, welche die Reaktion zwischen der gebundenen Nucleobase und dem aktivierten Zuckerphosphat katalysierten, erwarben automatisch eine cis-diol- Gruppe. Nach diesem Prinzip konnte die katalytische RNA nach Periodatoxidation und Immobilisierung mit einer Hydrazidfestphase und anschließender Laserspaltung bzw. durch Affinitätsgelelektrophorese von den inaktiven RNA- Spezies abgetrennt werden. Der RNA-Teil dieser isolierten Produkte wurde anschließend enzymatisch amplifiziert und erneuten Cyclen aus Transkription, Konjugation, Inkubation und Selektion unterworfen. Es konnten jedoch keine katalytischen RNA-Moleküle angereichert werden. Aufgrund einer ganzen Reihe von Eigenschaften ist RNA prädestiniert für den Einsatz als Biosensor: sie zeichnet sich durch präzise molekulare Erkennung, schnelle Ausbildung von Strukturen und enzymatische Funktion aus. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein dynamisches System zur direkten und nicht radioaktiven Bestimmung von Konzentrationen des Theophyllins auf der Basis des Theophyllinaptamers und des Hammerheadribozyms entwickelt. Durch den Einsatz des Fluoreszenzenergietransferprinzips konnte die zeitaufgelöste kinetische Analyse einer der Theophyllinkonzentration entsprechenden Ribozymaktivität durchgeführt werden. Unser Sensorsystem besteht aus einem Ribozymstrang und einem zweifach gelabelten Substratstrang, der in Anwesenheit von Theophyllin selektiv gespalten wird. Bei Anregung mit Licht der Fluorescein typischen Wellenlänge wird Fluoreszenz freigesetzt. Dieser Fluoreszenzanstieg korreliert mit der Spaltungsgeschwindigkeit und damit der anwesenden Theophyllinkonzentration. Die Nachweisgrenze lag bei 0.01 - 2 mM, wobei Coffein dieses System unter den hier gewählten Bedingungen nicht beeinflußte. Diese auf der Basis von RNA-Technologie und modernen Fluoreszenzdetektionsverfahren entwickelte Methode zur Konzentrations- bestimmung bietet Raum für weiterführende Verbesserungen und Verfeinerungen wie auch für die Erweiterung auf eine Vielzahl von anderen Analyten.

Summary The catalytic activity of ribonucleic acids is essential for probable prebiotic processes. The formation of C-N bonds is most important for the metabolism in a hypothetical RNA world. This work describes the development of a selection scheme for the isolation of a new ribozyme for the N-glycosidic bond formation between an activated sugar phosphate and a nucleobase. This catalytic RNA should be isolated from a combinatorial RNA library with the use of in vitro selection techniques. The principle of direct selection was extended to "direct selection with linkercoupled reactants". This new selection scheme requires the sitespecific introduction of one reactant via a flexible linker to all RNA-pool members. Using T4 RNA ligase, a method for enzymatic introduction of synthetic linkers to the 3´end of RNA was developed. Nicotinic and orotic acid could be directly and specifically attached to the 3´end of RNA via a flexible linker. Those molecules that catalyzed the reaction between the bound nucleobase and the activated sugar phosphate acquire automatically a cis-diol group. So the catalytic RNA molecules could be separated from inactive species via oxidation with periodate, immobilisation on a hydrazine modified solid phase and subsequent laser induced cleavage or affinity gelelectrophoresis. The RNA part of the isolated products was enzymatically amplified and subjected to further rounds of transcription, conjugation and selection. No catalytically active RNA molecules could be isolated. RNA is predestinated for the use as a biosensor due to it´s precise molecular recognition, fast formation of structures and enzymatic function. In this work a dynamic system was developed for the direct and nonradioactive detection of theophylline on the basis of the hammerhead ribozyme and the theophylline aptamer. The time resolved kinetic analysis of theophylline dependend ribozyme activity could be performed with the use of the "molecular beacon" technology. Our sensor consists of a ribozyme part and double modified substrate, which is selectively cleaved in the presence of theophylline. The increase of fluorescence was proportional with the cleavage rates and therefore an indicator of the actual theophylline concentration. Theophylline could be detected in concentrations of 0.01 - 2 mM. Coffeine did not influence the system. This method was developed on the basis of RNA technology and modern fluorescence detection strategies and is well suited for further refinements and improvements, and the extension to a variety of other analytes.