Rolle der PAX2-Splicevarianten in Lymphomen und soliden Tumoren

Abstract

Das PAX2-Gen kodiert einen Transkriptionsfaktor mit bedeutender Funktion während der Embryogenese. Nach Abschluss der Zelldifferenzierung ist eine Expressionsabnahme beschrieben. Demgegenüber konnte in zahlreichen humanen Neoplasien eine PAX2-Überexpression gezeigt werden, die wichtig für das Überleben und Wachstum von Tumorzellen zu sein scheint. Diese Arbeit untersuchte die Expression von PAX2 und zwei der vier bekannten Splicevarianten (+Exon 6 und +Exon 10) sowie die Expression der in unserer Arbeitsgruppe entdeckten Intron 9-positiven Variante in Zelllinien solider Tumore und Lymphome auf mRNA-Ebene (quantitative Real-Time-PCR, LightCycler®-Prinzip) und Proteinebene (Western-Blot). Zwischen den Zelllinien solider Tumore und Lymphome konnte kein Unterschied des Expressionsmusters und des Expressionslevels von PAX2 sowie der untersuchten Splicevarianten auf mRNA- und Proteinebene festgestellt werden. Ihre Expression konnte somit nicht spezifisch hämatologischen bzw. soliden Tumorzelllinien zugeordnet werden. PAX2 und die drei Splicevarianten wurden hier auch in Gesundblutproben nachgewiesen. Die medianen Expressionslevel lagen auf mRNA-Ebene stets über denen der Zelllinien. Der Nachweis von PAX2-(Splicevarianten) mRNA im Blut ist folglich nicht tumorspezifisch und kann daher nicht als MRD-Marker herangezogen werden. Auf Proteinebene konnte PAX2 ebenfalls im Gesundblut nachgewiesen werden. Ob es einen Unterschied zwischen gesunden und malignen Zellen hinsichtlich der Lokalisation und der Funktion des PAX2 Proteins (Zytoplasma/ Nukleus) gibt, muss in weiteren Untersuchungen gezeigt werden. Zusätzlich konnten alle Splicevarianten im Kolonkarzinomgewebe detektiert werden. In einem weiteren Teil der Arbeit wurde die Expression des Transkriptionsfaktors WT1 sowie die der Exon 5- bzw. KTS-positiven WT1-Splicevarianten in den gleichen Zelllinien auf mRNA-Ebene untersucht. WT1 spielt eine bedeutende Rolle bei der Entwicklung der Niere und des Urogenitaltraktes. Darüber hinaus konnte eine Überexpression in vielen Tumorerkrankungen gefunden werden, die analog zu PAX2 für das Überleben und Wachstum der Tumorzellen bedeutend zu sein scheint. Eine in der embryonalen Niere gezeigte, wechselseitige Interaktion der beiden Gene, bei der PAX2 den WT1-Promotor aktiviert und WT1 zur PAX2-Expressionsreduktion führt, wird auf Grund korrelierender Expressionsmuster auch in mehreren Tumorentitäten vermutet. Zur Prüfung der vermuteten Interaktion wurden die Expressionslevel von PAX2 und WT1 sowie der betrachteten Splicevarianten korreliert. Nur für das splicevarianten-unabhängige PAX2-Transkript und WT1 +Exon 5 ergab sich bei den Lymphom-Zelllinien eine signifikante lineare Korrelation. Ein allgemeines, bzw. splicevarianten-spezifisches Regulationsprinzip für PAX2 und WT1 in verschiedenen Tumorentitäten konnte nicht gezeigt werden. Funktionell konnte die Interaktion der beiden Gene über RNA-Interferenz hier nicht gezeigt werden und muss in weiteren Studien geprüft werden. Der Nachweis einer Interaktion könnte neue therapeutische Interventionsmöglichkeiten eröffnen und das Verständnis der Tumorzellregulation vertiefen, da die Fortleitung von Aktivierungssignalen beider Transkriptionsfaktoren in mehrere untergeordnete Signalwege an dieser Schnittstelle unterbunden werden könnte.

The paired box gene PAX2 encodes a transcription factor which is crucial during embryogenesis. A decline of the PAX2 expression is described after terminal differentiation. Contrary to this, in numerous human tumours an over expression of PAX2 has been shown. Thus PAX2 seems to be important for tumour cell survival. This research investigated the expression of PAX2 and two of its four known splice variants (+exon 6 and +exon 10), as well as the expression of the intron 9-positive variant previously discovered in our laboratory. The expression was analysed in cell lines of solid tumours and lymphoma on mRNA-level (quantitative real time PCR, LightCycler®) and protein- level (Western Blot). No significant difference could be shown between cell lines of solid tumours and lymphoma concerning the expression pattern and the expression level of the investigated PAX2 variants. Thus the expression is neither distinctive for solid nor for hematological tumour cells. Furthermore, the expression of PAX2 and its three splice variants was shown in blood samples taken from healthy donours. The median mRNA-expression level was higher than in tumour cells. The detection of PAX2 and its variants on mRNA- level in blood does therefore not characterize the presence of tumour cells and should not be used as MRD-marker. On protein-level, evidence of PAX2 was provided in blood samples from healthy donours. Further research will have to be done to verify whether there is a difference in localisation and function (cytoplasm/ nucleus) of the PAX2 protein between healthy and malignant cells. Furthermore, all PAX2 splice variants here examined could be detected in colon carcinoma tissue. Additional research was conducted to explore the expression of the transcription factor WT1 as well as its exon 5- and KTS-positive variants on mRNA-level. WT1 plays an important role during the development of the kidney and the genitourinary system. Besides, an over expression of WT1 was found in many tumour diseases. This seems to point out the importance for growth and survival of the tumour cells similar to PAX2. A reciprocal interaction between both transcription factors was described in the fetal kidney in such a way that PAX2 activates the WT1 promoter and WT1 reduces the PAX2 expression. Due to correlating expression samples, this interaction is assumed in various tumour entities. To investigate this assumption, expression levels of PAX2 and WT1 as well as their splice variants were correlated. A significant correlation was only shown in lymphoma cell lines for the PAX2 transcript which is unaffected by alternative splicing and the exon 5-positive WT1-transcript. None of the tumour entities examined showed regulation principles neither of a general kind nor specific to splice variants. The interaction between both transcription factors could not be shown functionally via RNA-interference and will have to be investigated in further studies The confirmation of such interaction could provide new therapeutical options and improve the comprehension of tumour cell regulation. Signals for tumour cell survival caused by either transcription factor could thus be interrupted at this intersection.