Einzelkanalmessungen zur Charakterisierung eines CCL21-abhängigen Chloridkanals auf Mikrogliazellen

Abstract

Die Mikrogliazelle stellt eine im Zentralen Nervensystem (ZNS) angesiedelte immunkompetente Zelle dar, welche die Fähigkeit zur Phagozytose und zur Präsentation von Antigenen besitzt. Signalmoleküle, welche zur Aktivierung der Mikroglia führen und deren Auswirkung auf die Zelle sind bis jetzt wenig erforscht. Der CC-Chemokin-Ligand CCL21 scheint als wichtiger Mediator bei dieser Aktivierung zu dienen. Lokale Stimulation von kultivierten Mikrogliazellen mit CCL21 führte auf Einzelkanalebene zu einer Änderung der Leitfähigkeit, welche für ungefähr 30 Minuten anhielt, auch nachdem CCL21 aus der Badlösung entfernt wurde. In Einzelkanalmessungen wurden mit Hilfe von Patch-clamp-Experimenten im cell-attached-Modus einzelne Ionenkanäle nach CCL21-Stimulation untersucht. Der so charakterisierte Kanal besaß eine Leitfähigkeit von 9,3 ± 2,1 pS und ein kalkuliertes Umkehrpotential von ungefähr 0 mV. In den durchgeführten Experimenten hatte der Kanal fast ausschließlich ein Leitwertniveau im Amplitudenhistogramm. Zur Bestätigung der elektrophysiologischen Ergebnisse konnte mit Imaging-Experimenten gezeigt werden, dass lokale CCL21-Stimulation zur Änderung der intrazellulären Konzentration von Chloridionen in kultivierten Zellen führt. Diese Änderung konnte mit dem Chlorid-sensitiven Farbstoff N-[ethoxycarbonylmethyl]-6 -methoxy-quinoliniumbromide (MQAE) dargestellt werden. Weiterhin zeigten Imaging-Experimente an kultivierten Mikrogliazellen erstmals, dass die Änderung der extrazellulären Chloridionenkonzentration einen Einfluss auf die intrazelluläre Chloridionenhomöostase besitzt. Abschließend kann man zusammenfassen, dass CCL21 die Öffnung eines Chloridkanals in kultivierten Mikrogliazellen auslöst und sich damit die intrazelluläre Chloridionenkonzentration ändert. Man kann davon ausgehen, dass der durch CCL21 ausgelöste Chloridstrom eine Rolle in der Migration der Mikroglia im verletzten Hirn spielt und damit in der Neuron-Mikroglia-Interaktion eine entscheidende Funktion hat.

Microglia, one of the glial cell types in the central nervous system (CNS) play an important role as resident immunocompetent and phagocytic cells in case of injury and disease. A candidate for signalling neuronal injury to microglial cells is the CC chemokine ligand CCL21, which is released by damaged neurons. Local application of CCL21 for 30 seconds to cultured microglia triggered a chloride conductance which lasted for 30 minutes even after CCL21 was washed out. Using cell attached patch clamp experiments, the single channel conductance was calculated to be 9.3 ± 2.1 pS and the reversal potential was around 0 mV, which is typical for chloride channel activity. The channel normally showed one conductance level in the amplitude histogram. To confirm the electrophysiological data, imaging experiments were established, which revealed that local CCL21 stimulation results in chloride influx into the cytoplasm of cultured microglia. These changes were detected by the fluorescent chloride sensitive dye N-[ethoxycarbonylmethyl]-6-methoxy- quinoliniumbromide (MQAE). Furthermore, it was demonstrated for the first time that intracellular chloride concentration can be changed by varying the extracellular chloride concentration. In conclusion, CCL21 evokes opening of a chloride channel in cultured microglia and leads to altered intracellular chloride concentrations. This mechanism may be involved in microglial migration towards sites of injury in the brain and seems to be crucial for the neuron-microglial signalling system.