Der Einfluss von Doxorubicin auf die Expression von Resistenzgenen und auf die Empfindlichkeit gegenüber Fluconazol bei Candida dubliniensis und Candida glabrata

Abstract

Candida spp. stellen durch die hohe Prävalenz von immunsupprimierten Patienten ein zunehmendes Problem bei nosokomialen Infektionen dar. Die häufigste Candida spp. ist C. albicans. Jedoch sind im verstärkten Maße auch sogenannte Nicht-C. albicans spp., wie C. glabrata und C. dubliniensis, in klinischen Proben zu finden (Ruhnke, 2006; Current Drug Targets). Candida spp. sind in der Lage, schwerwiegende systemische Infektionen und Erkrankungen auszulösen, die durch die Entwicklung von Resistenzen kompliziert werden können. Gerade Patienten in der Hämatologie/Onkologie sind dabei aufgrund ihres herabgesetzten Immunstatus einem besonderen Risiko ausgesetzt, eine Infektion mit Candida spp. zu entwickeln. Wechselwirkungen zwischen Chemotherapeutika und dem Resistenzverhalten von Candida spp. geraten in zunehmendem Maße in den Blickpunkt wissenschaftlicher Fragestellungen. Für Doxorubicin, welches ein in der Hämatologie/Onkologie häufig eingesetztes Chemotherapeutikum ist, konnte bereits durch Kofla et al. gezeigt werden, dass es bei C. albicans zu einer Aktivierung von Resistenzmechanismen und einer Zunahme der Fluconazol-Toleranz führen kann (Kofla et al., 2011; Medical Mycology). Aufgabe dieser Arbeit war es, diesen Zusammenhang auch für die Nicht-C. albicans spp. C. dubliniensis und C. glabrata zu untersuchen. C. glabrata ist eine der wichtigsten Nicht-C. albicans spp. und ist nach C. albicans am zweithäufigsten in klinischen Proben zu finden (Li et al., 2007; Journal of Dental Research). C. dubliniensis ist sehr nah mit C. albicans verwandt und wurde aufgrund der Ähnlichkeit erst 1995 klassifiziert (Sullivan et al., 1995; Microbiology). Mehrere Isolate der beiden Candida spp. wurden in doxorubicinhaltigem und doxorubicinfreiem Minimal- bzw. Vollmedium kultiviert. Es wurden Kurzzeitversuche über 90 Minuten sowie Langzeitversuche über 10 Tage durchgeführt. Im Verlauf dieser Experimente wurde in regelmäßigen Abständen die Expression ausgewählter Resistenzgene untersucht und die minimale Hemmkonzentration (MHK) für Fluconazol bestimmt. Im Anschluss daran wurde in einem Chequerboard-Versuch das Wachstum der C. dubliniensis- und C. glabrata-Isolate in einem Medium untersucht, welches sowohl Doxorubicin als auch Fluconazol in unterschiedlichen Konzentrationen enthielt. Bei C. dubliniensis wurde durch den Einfluss von Doxorubicin im Kurzzeit- und im Langzeitversuch das ABC- Transportergen CDR2 überexprimiert. Eine durch Doxorubicin induzierte Aktivierung der Resistenzgene CDR1, MDR1, ERG3 und ERG11 konnte nicht beobachtet werden. Die Wahl des verwendeten Mediums spielte in Bezug auf die Stärke der Genexpression bei C. dubliniensis eine untergeordnete Rolle. Im Rahmen der MHK-Bestimmung sowie des Chequerboard-Versuchs kam es, abhängig von der Doxorubicin-Konzentration, zu einer um bis zu vier Titerstufen gesteigerten MHK für Fluconazol. Dieser Anstieg der Fluconazol-Toleranz von C. dubliniensis konnte bereits nach einer 48-stündigen Kultivierung in doxorubicinhaltigen Medium beobachtet werden und war nach einer Kultivierung in doxorubicinfreiem Medium reversibel. Im Vergleich zu C. albicans zeigte C. dubliniensis damit, sowohl bei der Aktivierung des CDR2-Gens als auch bei der Steigerung der Fluconazol-Toleranz, einen ähnlichen Effekt auf die Kultivierung in doxorubicinhaltigem Medium. Bei C. glabrata konnte eine durch Doxorubicin induzierte Überexpression des ABC-Transportergens CDR1 sowie eine leicht gesteigerte Expression von CDR2, SNQ2 und PDR1 beobachtet werden. Im Gegensatz zu C. dubliniensis war die Aktivierung der untersuchten Gene erst im Langzeitversuch festzustellen. Das Medium hatte bei C. glabrata im Vergleich zu C. dubliniensis einen stärkeren Einfluss auf die Genexpression. Während es bei der Kultivierung in einem Vollmedium zu einer konstant hohen Genexpression kam, sank diese in einem Minimalmedium im Verlauf des Langzeitversuchs ab. Zudem war Doxorubicin bei einigen C. glabrata-Isolaten in der Lage, eine Fluconazol-Resistenz zu induzieren. Anders als bei C. dubliniensis, wo eine erhöhte Fluconazol-Toleranz bereits nach 48 Stunden beobachtet werden konnte, manifestierte sich diese bei C. glabrata erst nach sechs bis acht Tagen. Vermutlich war dieser Prozess bei C. glabrata mit dem Auftreten von petite mutants assoziiert. Diese atmungsdefizienten Mutanten treten auch bei Saccharomyces cerevisiae auf. Bei diesem nahen Verwandten von C. glabrata konnte bereits durch Buschini et al. gezeigt werden, dass Doxorubicin in der Lage ist, petite mutants zu selektionieren (Buschini et al., 2003; Mutagenesis). Die Mechanismen der Resistenzentstehung unterschieden sich demnach in den untersuchten Candida spp. grundsätzlich, wobei sowohl bei C. dubliniensis als auch bei C. glabrata eine Assoziation zwischen der Erhöhung der Fluconazol-Toleranz und der Überexpression von ABC-Transportergenen bestand. Die Ergebnisse dieser Arbeit sind potenziell von klinischer Bedeutung, da sie einen möglichen Erklärungsansatz für das Auftreten von Antimykotika-Resistenzen bei C. dubliniensis und C. glabrata bei onkologischen Patienten liefern. Sie könnten in diesem Zusammenhang helfen, durch das Vorbeugen einer Resistenzentwicklung, die hohe Letalität von Candida- Infektionen in diesem besonders gefährdeten Patientenkreis zu senken.

Due to the high prevalence of immunocompromised patients Candida infections emerge as an increasing problem with C. albicans as the most common Candida spp. In recent years the occurrence of non-C. albicans spp. such as C. dubliniensis and C. glabrata is increasing in clinical samples (Ruhnke, 2006; Current Drug Targets). Candida spp. can cause serious systemic infections which are becoming complicated by the development of azole-resistance. Particularly, patients in hematology/oncology have a high risk because of their immunodeficiency. Interactions between chemotherapeutic agents and the pattern of resistance in Candida spp. become to an increasing degree the focus of scientific questions. For doxorubicin, a frequently used chemotherapeutic agent was shown that the drug is capable of inducing mechanisms of resistance and leading to an increased azole-tolerance in C. albicans (Kofla et al., 2011; Medical Mycology). The aim of this dissertation was to investigate this relationship for the non-C. albicans spp. C. dubliniensis and C. glabrata. C. glabrata is after C. albicans one of the most common Candida spp. in clinical samples (Li et al., 2007; Journal of Dental Research). In contrast, C. dubliniensis does not occur very often, but is closely related to C. albicans. Various isolates of C. dubliniensis and C. glabrata were incubated in different mediums with 20 μg/ml doxorubicin for 90 min and in a second experiment for up to ten days. Samples were taken on subsequent days for the determination of the minimal inhibition concentration (MIC) for fluconazole and gene expression analyses. In addition, in a chequerboard experiment the MIC values for fluconazole of C. dubliniensis and C. glabrata were investigated in a medium with different concentrations of doxorubicin. In C. dubliniensis the ATP-binding cassette transporter CDR2 was upregulated in all doxorubicin-treated isolates during short term and long term exposure. An induction of the expression of the resistance genes CDR1, MDR1, ERG3 and ERG11 was not observed. An effect on the intensity of expression caused by the use of different mediums could not be shown. The MIC for fluconazole during the long term exposure and the chequerboard experiments increased in a doxorubicin concentration-dependent manner. This effect occurred already after 48 hours of incubation and was reversible after an incubation in doxorubicin-free medium. In comparison to C. albicans C. dubliniensis present a similar effect on the incubation in doxorubicin-containing medium. In C. glabrata doxorubicin induced an over-expression of the ATP-binding cassette transporter CDR1 and a lightly increased expression of CDR2, SNQ2 and PDR1. In contrast to C. dubliniensis, the activation of these genes was only observed in the long term incubation and an effect on the intensity of expression caused by the use of different mediums could be shown. In addition, in several isolates of C. glabrata doxorubicin was able to induce a fluconazole-resistance. This fluconazole-resistance could be observed after 6 to 8 days during the long term incubation. Probably this process was associated with the occurrence of petite mutants. These respiratory deficient mutants are already investigated in Saccharomyces cerevisiae. In this close relative to C. glabrata Buschini et al. could reveal that doxorubicin was able to select petite mutants (Buschini et al., 2003; Mutagenesis). The mechanisms of the development of resistance are consequently different in C. dubliniensis and C. glabrata, although in both species an association between the increase of fluconazole-tolerance and the over-expression of ATP-binding cassette transporter exist. This dissertation has a potential clinical relevance due to the fact that it shows an approach for the occurrence of azole-resistance in C. dubliniensis and C. glabrata in cancer patients. In this context it could help to prevent the development of resistance and therefore to reduce the high mortality of infection with Candida spp. in this group of high-risk patients.