Structural and functional analysis of cGMP dependent protein kinase I (cGKI) and LIM kinase 1 (LIMK1) engaged in BMP signaling crosstalk

Abstract

The aim of this Ph.D. research was to understand the structural basis of cGMP- dependent protein kinase I ß (cGKIß) involved in pulmonary arterial hypertension (PAH), and of LIM Kinase 1 (LIMK1) as a key drug target for cancer metastasis. It was suggested that the downstream activity of cGKI is a pivotal regulator of PAH and vasodilation, and its interaction with BMP receptor II (BMPRII) tail region can recover PAH effects. BMPRII tail is also a docking site for LIMK1, which determines the balance between actin polymerization and depolymerisation. Therefore, the identification and structure determination of LIMK1 is of particular significance. Moreover, we investigated docking sites on the BMPRII tail for both cGKI ß and LIMK1 to provide new insight into signaling mechanisms and also to identify specific chemical inhibitors with potential for therapeutic development. During this work, bacterial and baculoviral expression systems were established generating high yields of the target proteins and to determine their kinase activity in vitro. Interestingly, cGKI ß thermal stability and inhibitor binding were changed by cGMP. It is possible to speculate that the binding of cGMP to the cGMP-binding domains leads to large conformational changes affecting the accessibility of the ATP binding pocket. Furthermore, putative interaction sites in BMPRII using peptide arrays were also identified and validated indicating that cGKIß shows high affinity binding to the N-terminal region of BMPRII-tail (GEKNRNSIY, aa 581- aa 589). cGKIß binds also another tail region (EPHVVTVTMNG, aa 797- aa 888) with a weaker affinity, due to BMPRII-tail secondary structure. In addition, binding data showed that peptide SNLKQVETGVAKMNTINAA (aa 777- aa 796) is a BMPRII- tail docking site for the N-terminal region of LIMK1. In the present work, the first X-ray crystal structure of LIMK1 kinase domain was determined at 1.65 Å resolution in complex with the promiscuous inhibitor staurosporine. Small molecule kinase inhibitors, with potential application against tumour cell invasion and metastasis, were used as template for molecular docking (pdb id 3S95), obtaining reliable docking solution. LIMK1 kinase domain is shifted towards an active kinase domain conformation, this evidence is also supported from enzymatic kinase activity studies, showing its ability to directly phosphorylate cofilin 1.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Strukturanalyse der cGMP-abhängigen Proteinkinase Iβ (cGKIβ) sowie der LIM Kinase I (LIMKI). Es wird vermutet, dass der Aktivität der cGKIβ eine Schlüsselrolle bei der pulmonären arteriellen Hypertension (PAH) und der Blutgefäßerweiterung zukommt: cGKIβ bindet an den BMPRII-Tail. Die Überexpression von cGKIβ verringert die durch Mutationen im BMPRII hervorgerufene PAH. Demzufolge war die Analyse der cGKIβ- BMPRII-Interaktionsstellen von besonderer Bedeutung. Die Aufklärung der LIMK1-Struktur ist ebenfalls von größter Wichtigkeit: Die LIMK1-BMPRII- Interaktion beeinflusst die Phosphorylierung von Cofilin und damit die Polymerisation von Aktin sowie die Struktur des Cytoskeletts. Außerdem ist LIMK1 an der Metastasierung von Tumoren beteiligt. Struktur und Interaktionsstellen von LIMK1 und BMPRII oder cGKIβ und BMPRII ermöglichen neue Einblicke in die molekularen Mechanismen der Signaltransduktion und die Entwicklung von therapeutischen Maßnahmen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden bakterielle und baculovirale Expressionssysteme etabliert, die eine hohe Ausbeute der beiden Kinasen cGKIβ und LIMKI und die in vitro Analyse ihrer Aktivität ermöglichen. Interessanterweise, ändert sich in Gegenwart von cGMP die thermische Stabilität von cGKIβ und die Bindung von cGKIβ an Inhibitoren. Das lässt vermuten, dass die Bindung von cGMP an die cGMP-Bindungsdomänen Konformationsänderungen der cGKI verursacht, die den Zugang zur ATP- Bindungstasche beeinflussen. Außerdem wurden durch den Peptid-Array mögliche cGKIβ-BMPRII-Interaktionsstellen identifiziert und validiert: cGKI zeigte eine hohe Affinität zur N-terminalen Region des BMPRII-Tails (GEKNRNSIY, aa 581- aa 589) und aufgrund der Sekundärstruktur des BMPRII-Tails eine geringere Affinität zur Tail-Region (EPHVVTVTMNG, aa 797- aa 888). Darüber hinaus konnte anhand von Bindungsdaten das Peptid SNLKQVETGVAKMNTINAA (aa 777- aa 796) als die Bindungsregion des BMPRII-Tails an die N-terminale Region der LIMK1 identifiziert werden. Durch diese Arbeit wurde außerdem die Röntgenstruktur der Kinase-Domäne von LIMK1 im Komplex mit dem Inhibitor Stauroporine (Auflösung 1,65 Å) aufgeklärt (pdb id 3S95). Kleine Molekül-Kinase- Inhibitoren, die das Potential haben, die Metastasierung und Invasion von Tumoren zu hemmen, wurden zur Simulation der molekularen Bindung benutzt. Dabei zeigte sich, dass die LIMK1 Kinase-Domäne in eine aktive Kinase-Domäne umgewandelt wird. Bestätigt wird dieses Ergebnis durch enzymatische Kinase- Studien, in denen die Fähigkeit Cofilin 1 zu phosphorylieren untersucht wurde.