dc.contributor.author
Busse, Susan
dc.date.accessioned
2018-06-07T17:31:57Z
dc.date.available
2010-06-08T06:21:20.910Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/3946
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-8146
dc.description
Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis I Abbildungsverzeichnis VI
Tabellenverzeichnis VIII Abkürzungen IX Einleitung 1 1\. Globale Genregulation
bei Mikroorganismen 1 1.1. Globale Regulation der Genexpression durch
Sigmafaktoren 2 1.2. Die Regulation der Genexpression durch
Transkriptionsfaktoren 4 1.3. Signaltransduktion und Genregulation durch Zwei-
Komponentensysteme als Antwort auf spezielle Umweltbedingungen 7 1.3.1. Aufbau
und Funktionsweise von Zwei-Komponentensystemen 7 1.3.1.1. Klassische Zwei-
Komponentensysteme 8 1.3.1.2. Phosphorelay-Zweikomponentensysteme 11 1.3.1.3.
Modulation von Zweikomponentensystemen durch „Connectors“ 12 1.3.2.
Phosphorelaysysteme und ihre Funktion in E.coli 13 1.3.2.1. Das
RcsC/D/B-System und Biofilmregulation 14 1.3.2.2. Das BarA/UvrY-System und das
Csr-Sytem bei der Biofilmregulation 16 1.3.2.3. Das ArcB/ArcA-System und die
generelle Stressantwort 17 1.4. Neue Regulationsmechanismen durch kleine RNAs
18 1.4.1. Funktionsweise von kleinen regulatorischen RNAs 20 1.4.2. Funktion
der kleinen RNA RprA in Escherichia coli 23 1.5. Biofilmbildung in
Mikroorganismen 25 1.5.1. Biofilmbildung in E.coli 27 1.5.2. CsgD als
essentieller transkriptionaler Regulator der adhäsiven Curli- Fimbrien und
anderer Biofilmfunktionen 29 Zielsetzung 31 Material und Methoden 33 1\.
Chemikalien, Materialien und Geräte 33 2\. Medien und Medienzusätze 34 2.1.
Flüssigmedien 34 2.2. Feste Medien 34 2.3. Medienzusätze 35 3\.
Bakterienstämme, Bakteriophagen und Plasmide 35 4\. Mikrobiologische Methoden
46 4.1. Sterilisation 46 4.2. Wachstumsbedingungen 46 4.3. Aufbewahrung von
Bakterienstämmen 46 4.4. Bestimmung der Zelldichte in Flüssigkulturen 46 4.5.
Herstellung eines P1-Lysates 46 4.6. P1 Transduktion 47 4.7. Plattentests (
ß-Gal Plattenaktivitätstest, Motilitätstest, Kongorotplattentest,
Glycogenplattentest, Fluoreszenztest-Fuji Imager) 47 5\. Molekularbiologische
Methoden 49 5.1. Präparation chromosomaler und Plasmid DNA 49 5.2.
Konzentrations- und Reinheitsbestimmung von DNA 49 5.3.
Restriktionsenzymverdau 49 5.4. Agarosegelelektrophorese 49 5.5. Elution von
DNA-Fragmenten aus einem Agarosegel 50 5.6. Ligation von DNA-Fragmenten
(Sambroock et al.,1989 und Urban et al.,2007) 50 5.7. Transformation 50 5.8.
Polymerasekettenreaktion 51 5.9. Klonierung 56 5.10. Konstruktion von
Plasmiden (lacZ, gfp,) 57 5.11. Kreuzung von transkriptionalen und
translationalen lacZ-Fusionen ins Chromosom von Escherichia coli 57 5.12.
Konstruktion von Mutanten (Datsenko and Wanner, 2000) 58 5.13. Präparation von
Gesamt-RNA (Hot phenol/chloroform; Kit von Promega) 59 5.14. Konzentrations-
und Reinheitsbestimmung von Gesamt-RNA 59 5.15. Northernblotanalysen (mit
Agarosegelen und PAA-Gelen) 60 5.16. RNA-Stabilitätsanalysen (Rifampicin-
Abbau) 63 5.17. Transkriptomanalysen-Arrayanalysen (MWG-Protokoll zum Teil,
Kit Amersham) 63 6\. Biochemischen Methoden 64 6.1. SDS-Polyacrylamid-
Gelelektrophorese 64 6.2. Sensitive Coomassiefärbung von SDS-
Polyacrylamidgelen (Fairbanks-Färbung) 66 6.3. Immunoblotanalyse (Westernblot)
66 6.4. Überproduktion und Reinigung von BarA, BaeS, DcuB, RstB 67 6.5.
Bestimmung der Proteinkonzentration (Pierce) 67 6.6.
ß-Galaktosidaseaktivitätstest 68 6.7. In vitro Phosphorylierungsassay
(Autophosphorylierung, Transphosphorylierung) 69 6.8. Messung freier
Fettsäuren 70 6.9. Protein-DNA-Bindestudien (Electrophoretic Mobility Shift-
Experimente EMS) 70 7\. Computerprogramme und Internetadressen 71 Ergebnisse
72 1\. Die Rolle der patatin-ähnlichen Phospholipase RssA bei der Kontrolle
des ArcB/ArcA/RssB-Systems und anderer Zweikomponentensystemen 72 1.1. Das aus
der enzymatischen Aktivität von RssA hervorgehende Spaltungsprodukt LPG hemmt
die Autophosphorylierung von ArcB, RstB, BaeS und BarA in vitro 73 1.2. Die
ebenfalls aus der Spaltung hervorgehende freie Fettsäure – Palmitinsäure hat
keinen Einfluss auf die Autophosphorylierung von ArcB in vitro 75 1.3. RssA
zeigt Auswirkungen auf die genomweite Genexpression in vivo 76 1.4. Zeigt RssA
enzymatische Aktivität in Bezug auf andere Membrankomponenten wie Cardiolipin
in vitro? 80 2\. Die Rolle des Zweikomponentensystems RcsCDB und der kleinen
RNA RprA bei der Expression des Biofilmregulators CsgD und der adhäsiven
Curli-Fimbrien in E.coli 82 2.1. Das Rcs-System übt seinen Einfluss auf die
Curli-Expression über die kleine RNA RprA aus 83 2.1.1. Erhöhte RprA-Level in
der Zelle führen zu einer Aktivierung der rpoS – Gen-expression und zu einer
Inhibierung der csgB, yaiC und ydaM – Genexpression 84 2.1.2. RpoS-
Proteinlevel und CsgD-Proteinlevel in rcs-Mutanten spiegeln die
Genexpressionsdaten wider 89 2.1.3. Die RprA – RNA Mengen steigen beim
Übergang in die stationäre Phase an und sind in den verschiedenen Rcs-Mutanten
unterschiedlich ausgeprägt 91 2.1.4. Das RcsB-Regulon überlappt mit dem RprA-
Regulon 92 2.1.5. RprA hat einen Einfluss auf die Menge an csgDmRNA , nicht
jedoch auf deren Stabilität 96 2.2. Die durch RprA vermittelte Regulation
innerhalb der SigmaS/CsgD Kaskade 100 2.2.1. Die konstitutive, ektopische
Expression von RprA reduziert die Expression von csgB, yaiC und ydaM 100
2.2.2. Die ektopische Expression von CsgD::Gfp und YdaM::Gfp ist in
Anwesenheit von konstitutiv expremiertem RprA ebenfalls reduziert 101 2.3. Die
Rolle der csgD 5`UTR bei der RprA-vermittelten Regulation 102 2.3.1. Innerhalb
der csgD 5`UTR befinden sich zwei potentielle Bindestellen für RprA 103 2.3.2.
Eine translationale Kontrolle durch RprA erfolgt über die Bindestelle im
Trans-lationsinitiationsbereich von csgD 105 2.3.3. Die weiter stromaufwärts
in der csgD 5`UTR liegende potentielle RprA-Bindestelle spielt möglicherweise
eine Rolle bei der Transkriptionselongation 107 2.4. Mögliche andere RprA-
Targets 109 2.4.1. Die Regulation von GadE durch RprA 2.5. Das degenerierte
GGDEF/EAL-Protein YhdA (CsrD) aktiviert die CsgD-Expression durch Inhibition
der RprA-Expression 111 2.5.1. CsrD (YhdA) hat keinen Einfluss auf die
Stabilität von RprA 111 2.5.2. CsrD reprimiert die rprA-Transkription 114
2.5.3. CsrD reprimiert die rprA-Expression ist nicht über RcsB 115 3\. Der
Einfluss des Konnektors YmgB auf den „Output“ des Rcs-Systems 118 4\. Globale
Analyse von Zweikomponenten-Phosphorelay-Systemen hinsichtlich ihrer
Vernetzung (Crosstalk) untereinander und deren Einfluss auf den
Stationärphasen-Sigmafaktor SigmaS 121 4.1. Das Rcs-System – und dessen
Zielgene 123 4.2. Das BarA/UvrY – Zwei-Komponentensystem als ein hauptsächlich
linear wirkendes System 124 4.3. Das ArcB/ArcA – Zwei-Komponentensystem als
ein Kandidat für Crosstalk 125 5\. Beziehungen des Responseregulators RssB zu
anderen Zwei-Komponentensystemen 126 Diskussion 129 1\.
Zweikomponentensysteme: „Crosstalk“ und „unorthodoxe“ Regulation 129 2\. Die
Rolle der Phospholipase RssA bei der Kontrolle von ArcB/ArcA/RssB und anderen
Zweikomponentensystemen 135 2.1. Das RssA Spaltungsprodukt LPG hemmt neben
ArcB auch BarA, BaeS und RstB in ihrer Autophosphorylierung 135 2.2. Die
Wirkung auf Sensorkinasen ist spezifisch durch LPG vermittelt, Palmitinsäure
zeigt keine Autophosphorylierungshemmung 138 2.3. RssA hat globale
Auswirkungen auf die genomweite Genexpression 139 2.4. Das zu PG sehr ähnliche
Cardiolipin wird ebenfalls durch RssA gespalten 142 3\. Das RcsC/D/B-System
wirkt pleiotrop über die kleine RNA RprA 144 3.1. Die globale Wirkung von RcsB
ist überwiegend über die RNA RprA 144 3.2. Die Wirkung des Rcs-Systems und
RprA auf CsgD und Curli-Expression 146 3.2.1. RcsB reduziert die Curli-
Expression hauptsächlich über die RNA RprA 146 3.2.2. Das Haupttarget von RprA
innerhalb der Curli-Kaskade ist CsgD, aber auch YdaM ist beeinflusst 148
3.2.3. Die Regulation der csgD-Translation erfolgt über die direkte
Interaktion der kleinen RNA-RprA mit dem Translationsinitiationsbereich von
csgD 149 3.2.4. An der stromaufwärts in der csgD 5`UTR liegenden Bindestelle
für RprA wird in Anwesenheit von RprA möglicherweise die
Transkriptionselongation verhindert 150 3.2.5. YhdA (CsrD) reguliert CsgD über
RprA 151 4\. Das sS/CsgD/Rcs regulatorische Netzwerk und seine Rolle in der
generellen Stressantwort und Biofilmbildung in E.coli 154 5\. Ausblick 157
Zusammenfassung 159 Summary 161 Literaturverzeichnis 163 Anhang 188
dc.description.abstract
Zusammenfassung Zweikomponentensysteme sind wichtige Systeme von Bakterien,
die eine Anpassung an wid-rige Umweltbedingungen gewährleisten. Üblicherweise
erfolgt die Aktivierung eines Zwei-komponentensystems, indem eine Sensorkinase
(SK) ein meist externes Signal wahrnimmt, sich an ihrem konservierten
Histidinrest autophosphoryliert und im Anschluss daran das Phosphat auf einen
Aspartatrest innerhalb des zugehörigen Responseregulators (RR) über-trägt. Der
Responseregulator ändert in phosphorylierter Form seine Konformation und kann
dann häufig als Transkriptionsfaktor die Expression von Zielgenen
beeinflussen. Neben dieser „orthodoxen“ Aktivierung (Phosphotransfer von SK
auf RR) sind in den letzten Jahren immer mehr so genannte „nicht-orthodoxe“
Wege der Aktivierung von Zweikomponentensystemen charakterisiert worden. Eine
Möglichkeit dieser „nicht-orthodoxen“ Regulation innerhalb von
Zweikomponentensys-temen ist der Crosstalk. Dabei sind einige Sensorkinasen
unter bestimmten Bedingungen in der Lage neben ihren
Partnerresponseregulatoren auch weitere Responseregulatoren zu phosphorylieren
(Groban et al., 2009; Mika et al., 2005). Des Weiteren können erst kürzlich
beschriebene so genannte Konnektoren vielfältig eine Wirkung auf die Aktivität
von Zwei-komponentensystem-Proteinen ausüben. Konnektoren sind meist kleine
Proteine, die durch einen spezifischen Signaltransduktionsweg induziert werden
und in die Regulation durch ein anderes System, z.B. eines
Zweikomponentensystems, eingreifen. Innerhalb dieser Arbeit wurden drei
weitere dieser so genannten „nicht-orthodoxen“ Aktivie-rungsmechanismen
innerhalb von Zweikomponentensystemen identifiziert und/oder näher
charakterisiert. Erstens wurde die Fettsäure Lysophosphatidylglycerin (LPG)
als ein neues Effektormolekül, das an der Regulation von Sensorkinasen und
somit von Zweikomponentensystemen beteiligt ist, identifiziert. Es konnte
gezeigt werden, dass das aus der Spaltung von Phosphatidylglyce-rin durch die
Phospholipase RssA generierte Lysophosphatidylglycerin in vitro in der Lage
ist, die Sensorkinasen ArcB, BarA, BaeS und RstB in ihrer
Autophosphorylierungsfähigkeit zu hemmen. Freie Fettsäuren, die ebenfalls bei
der RssA-vermittelten Spaltung von Phospha-tidylglycerin entstehen, zeigten
keinen Einfluss auf die Autophosphorylierung von ArcB. Vorläufige Hinweise,
dass LPG tatsächlich auch in vivo relevant ist, lieferten Mikroarrayana-lysen,
die eine durch RssA/LPG vermittelte globale Auswirkung auf die Genexpression
zeig-ten. Neben Phosphatidylglycerin, als Substrat für die Phospholipase RssA,
konnte außerdem das strukturell sehr ähnliche Cardiolipin als ein zusätzliches
Substrat für RssA identifiziert werden. Ein weiteres Beispiel für einen
„nicht-orthodoxen“ Regulationsmechanismus, der innerhalb dieser Arbeit
untersucht wurde, ist die Verbindung des YcgF/YcgE-Signaltransduktions-systems
mit dem Rcs-System durch das kleine Protein YmgB. YmgB steht unter Kontrolle
des YcgF/YcgE – Signaltransduktionsweges. Nach Induktion des Proteins wurde
ein mukoi-der Phänotyp und eine Reduktion der Expression der Curlisynthesegene
beobachtet (Tschowri et al., 2009). Dieser mukoide Phänotyp wird durch die
Ausbildung der Kolansäure (ein Kap-selbestandteil) hervorgerufen und
resultiert aus der Aktivierung des Rcs-Systems. Mit Mikro-arrayanalysen konnte
gezeigt werden, dass YmgB eine Vielzahl Rcs-abhängiger Gene regu-liert, zu
denen auch die Curlisynthesegene zählen. Die Rcs-Komponenten selbst wurden je-
doch nicht in ihrer Expression beeinflusst. Demzufolge scheint das YmgB-
Protein als eine Art Konnektor die Aktivität der Rcs-Komponenten zu
modulieren. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass RcsB seine
Wirkung nicht nur auf direktem Wege als Transkriptionsfaktor ausübt, sondern
auch indirekt über die Aktivierung der kleinen RNA RprA wirken kann. Im Falle
des Transkriptionsregulators der Curlisynthesegene, CsgD, ist alleinig RprA
für die Repression von csgD verantwortlich. Dabei werden offenbar zwei
Bindestellen innerhalb der 5`UTR der csgDmRNA von RprA für die Regulation
genutzt. Eine mit der Ribosomenbindestelle überlappende Bindestelle dient der
Translationsregulation von csgD durch RprA. Eine wesentlich größere
regulatorische Rolle scheint jedoch die weiter stromaufwärts vom
Translationsstart liegende Bindestelle zu spielen. Vorläufige Untersu-chungen
deuten dabei auf eine Rolle bei der Transkriptionselongation. Innerhalb dieser
Arbeit konnte somit erstmalig gezeigt werden, dass der Transkriptionsregulator
der Curlisynthesege-ne, CsgD, der direkten Kontrolle der kleinen RNA RprA
unterliegt und dass diese posttranskriptionale Regulation offenbar durch zwei
unterschiedliche Mechanismen gewähr-leistet wird. Damit wurde unter anderem
demonstriert, dass nicht immer Responseregulatoren selbst für eine
Zielgenregulation verantwortlich sind, sondern dies, wie hier gezeigt, auch
über kleine RNAs realisieren können. Mit den Ergebnissen dieser Arbeit wird
einmal mehr deutlich, dass neben der „orthodoxen“ Aktivierung eine Vielzahl
„nicht-orthodoxer“ Wege der Aktivitätsregulation von Zweikom-ponentensystemen
existieren und dass durch diese komplexen Regulationsmöglichkeiten eine
optimale und fein abgestimmte Anpassung der Bakterien an die
unterschiedlichsten Umwelt-bedingungen erfolgen kann.
de
dc.description.abstract
Summary Two component systems are important systems in bacteria, which allow
an adaptation to un-favourable environmental conditions. Usually an activation
of two component systems is car-ried out by the activation of the sensor
kinase through an external signal, subsequent auto-phosphorylation at its
conserved histidin residue, followed by the phosphotransfer to an aspar-tate
residue within the cognate response regulator. Phosphorylation induces a
conformational change in the response regulator. Many response regulators are
DNA-binding proteins which, as a result of phosphorylation, function as
transcription factors that influence the expression of target genes. Besides
this “orthodox” activation (phosphotransfer from sensor kinase to response
regulator) an increasing number of so called “unorthodox” activation pathways
of two component systems have recently been characterized. Crosstalk
represents one example of “unorthodox” regulation within two component
systems. In addition to the phosphotransfer to their partner response
regulators, some sensor kinases are able to phosphorylate other response
regultators under certain conditions (Groban et al., 2009; Mika et al., 2005).
Furthermore, recently described so called connectors can have di-verse
influences on the activity of two component system proteins. Connectors are
usually small proteins, which are induced by a specific signal transduction
pathway and exert a regu-latory influence on other systems, such as two
component systems. In this thesis three additional “unorthodox” mechanisms of
regulation within two component systems could be identified and/or
characterized in detail. First, lysophosphatidylgycerol (LPG) was identified
as a new effector molecule which regu-lates sensor kinases and therefore two
component systems. It could be demonstrated that lysophosphatidylglycerol,
which is generated by RssA upon cleavage of phosphatidylglycerol, inhibits
autophosphorylation of the sensor kinases ArcB, BarA, BaeS and RstB in vitro.
Free fatty acids, which are also generated by RssA-mediated
lysophosphatidylglycerol cleavage, do not influence the autophosphorylation of
the sensor kinase ArcB. Preliminary evidence for an in vivo role of LPG was
obtained by microarray analysis, which showed an RssA/LPG mediated global role
in gene regulation. In addition to phosphatidylglycerol, the phospholipase
RssA can also use cardiolipin as a sub-strate, which shows a very similar
structure to phophatidylglycerol. The connection of the YcgF/YcgE signal
transduction pathway with the Rcs-system via the small protein YmgB, which was
also investigated in this thesis, is another example of an “un-orthodox”
mechanism of regulation within two component systems. YmgB is under control of
the YcgF/YcgE–signal transduction pathway. Induction of YmgB leads to a mucoid
pheno-type and the reduction of curli synthesis gene expression (Tschowri et
al., 2009). The mucoid phenotype is caused by production of colonic acid (a
capsule component) as a result of an activated Rcs-system. Microarray analysis
revealed many YmgB-regulated genes, including the curli synthesis genes and a
large number of RcsB-dependent genes. However the expres-sion of the Rcs-
components itself was not influenced by YmgB. Thus YmgB functions as a
connector which modulates the activity of the Rcs-components. Furthermore, it
could be demonstrated here that RcsB does not only exert its influence on
target genes directly as a transcription factor, but also indirectly
influences gene expression via activation of the small RNA RprA. In the case
of the curli regulator CsgD, the repression is mediated exclusively via the
small RNA RprA. Two possible binding sites within the 5`UTR of csgDmRNA seem
to be used by RprA for this regulation. One of the binding sites is
overlapping with the ribosome binding site and is responsible for
translational regulation of csgD by RprA. The other one is located further
upstream of the translational start site and seems to play the major
regulatory role. Preliminary results suggest a role of this binding site in
transcriptional elongation. This thesis provides the first evidence that the
transcriptional regulator of the curli synthesis genes, CsgD, is under direct
control of the small RNA RprA and that this posttranscriptional regulation is
probably ensured by two different mechanisms. This demonstrates that the
regulation of target genes by response regulators can also be medi-ated
indirectly, for example via a small RNA. The present study provides additional
evidence for the existence of “unorthodox” pathways of activity regulation
within two component systems, which act parallel to the “orthodox” pathways.
These complex mechanisms of regulation ensure an optimal and fine tuned
adapta-tion of microorganisms to diverse environmental conditions.
en
dc.format.extent
X, 204 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
two component systems
dc.subject
curli fimbriae
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Unorthodoxe Mechanismen der Regulation innerhalb von Zweikomponentensystemen
in Escherichia coli
dc.contributor.contact
susan.busse@arcor.de
dc.contributor.firstReferee
Frau Prof. Dr. Regine Hengge
dc.contributor.furtherReferee
Herr Prof. Dr. Kürsad Turgay
dc.date.accepted
2010-03-02
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000016590-4
dc.title.translated
Unorthodox mechanisms of regulation within two component systems in
Escherichia coli
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000016590
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000007283
dcterms.accessRights.dnb
free
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open access