Scalable differentiation of human pluripotent stem cells into in two and three-dimensional proximal tubule cells

Abstract

There is an increasing need for a highly standardized, scalable source of proximal tubular epithelial cells (PTEC) for pre-clinical models of the kidney, for large-scale substance-induced nephrotoxicity and drug screening, or for application in cell therapies. Major problems of classical resources of primary and immortalized PTEC are frequent dedifferentiation, lack of personalization, and non-availability of functional equivalence. These limitations can be solved by PTEC derived from human pluripotent stem cell (hPSC) which offers an endless cell source, specificity with each donor, capabiltity of genetic modifications. For these reasons, research using hPSC is widespread, but adequate technologies for mass production of hPSC and derived products are lacking. My goal was to develop an approach for hPSC-derived PTEC.

The first aim was to identify media composition which support the efficient generation of hPSC-derived PTEC in two dimensional (2D) culture. The second aim was to determine culture parameters for large scale generation of hPSC-derived PTEC in a bioreactor environment based on the identified media composition in 2D culture. In order to mass-produce hPSC-derived PTEC in an automated and reproducible way, the complete process of expansion and directed differentiation of hPSC was performed on matrix-coated alginate beads in a dynamic fluidics system, called biolevitation. Three dimensional (3D) culture in biolevitation showed significant improvements in both cell expansion and differentiation efficacy compared 2D culture. After 24 days, overall expansion of cells on matrix-coated alginate beads in biolevitation was 9-10 times. This yield was around 4 times higher than those in 2D culture. Besides expressing Aquaporin 1 (AQP1), Sodium-Potassium ATPase (Na⁺/K⁺-ATPase), Low-density lipoprotein-related protein 2 (LRP2/Megalin) and Sodium-glucose linked transporter-2 (SGLT2) like hPSC-derived PTEC in 2D culture. PTEC on beads showed expression of functional proteins for detoxification including organic anion transporters (OAT) and organic cation transporters (OCT). PTEC on beads were functional with respect to the reabsorbtion of glucose and albumin as well as in uptaking organic ions from peri-tubular capillaries. After treatment with the common chemotherapy agent cisplatin, PTEC on beads expressed Kidney injury marker-1 (KIM-1) indicating suitability for nephrotoxicity applications. Moreover, PTEC harvested from beads could form a monolayer and stably expressed functional solute transporters. My study was the first research of mass production of human PTEC using biolevitation and matrix-coated alginate beads

Es besteht ein zunehmender Bedarf für eine hoch standardisierte, skalierbare Quelle proximaler tubulärer Epithelzellen (PTEC) für präklinische Modelle der Niere, für substanzinduzierte Hochdurchsatz Nephrotoxizitäts- und Arzneimittelscreenings oder für die Anwendung in Zelltherapien. Hauptprobleme bei klassischen Ressourcen von primären und immortalisierten PTEC sind häufige Dedifferenzierung, fehlende Personalisierung und nicht- Verfügbarkeit von funktionaler Äquivalenz. Diese Einschränkungen können durch PTEC aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPSC) überwunden werden, die eine unlimitierte Zellquelle, Spenderspezifität und die Fähigkeit genetischer Modifikationen bieten. Aus diesen Gründen ist die Forschungsverwendung von hPSC weit verbreitet, es fehlen jedoch adäquate Technologien für die Massenproduktion humaner PSC und abgeleiteter Produkte. Mein Ziel war es, hierfür einen Ansatz für hPSC – abgeleitete PTEC zu entwickeln. Das erste Ziel bestand darin, Medienzusammensetzungen zu identifizieren, die die effiziente Erzeugung von hPSC-abgeleiteten PTEC in zweidimensionaler (2D) Kultur unterstützen. Das zweite Ziel war die Bestimmung von Kulturparametern für die Generierung von hPSC-abgeleiteten PTEC im großen Maßstab in einer Bioreaktorumgebung basierend auf der identifizierten Medienzusammensetzung in 2D Kultur. Um hPSC-abgeleitete PTEC auf automatisierte und reproduzierbare Weise in Massenproduktion herzustellen, wurde der vollständige Prozess der hPSC-Expansion und gerichteten Differenzierung an neuartigen matrixbeschichteten Alginatkügelchen in einem dynamischen Fluidiksystem namens Biolevitation durchgeführt. Die 3D-Kultur in Biolevitation zeigte signifikante Verbesserungen sowohl der Zellexpansion als auch der Differenzierungseffizienz im Vergleich zur 2D-Kultur. Nach 24 Tagen betrug die Gesamtexpansion der Zellen auf matrixbeschichteten Alginatkügelchen in Biolevitation das 9- bis 10-fache. Diese Ausbeute aus der Biolevitation war etwa 4-mal höher als bei der 2D-Kultur. Neben der Expression von Aquaporin 1 (AQP1), Natrium-Kalium-ATPase (Na⁺/K⁺-ATPase), Megalin und Natrium-Glucose-linked Transporter-2 (SGLT2) wie hPSC-abgeleitete PTEC in 2D-Kultur, PTEC auf Kügelchen zeigte die Expression funktioneller Proteine für die Entgiftung, einschließlich Transporter für organische Anionen (OAT) und Transporter für organische Kationen (OCT). PTEC waren funktionell in Bezug auf die Reabsorption von Glucose und Albumin sowie bei der Aufnahme organischer Ionen aus peritubulären Kapillaren. Nach der Behandlung mit dem gängigen Chemotherapeutikum Cisplatin exprimierten PTEC den Kidney Injury Marker-1 (KIM-1), was auf die Eignung für Nephrotoxizitätsanwendungen hinweist. Darüber hinaus eine effiziente Zellernte möglich; die geernteten PTEC bildeten mit funktionellen Transportern ausgestattete Epithelteppiche. Meine Studie war die erste Forschung für die reproduzierbare Massenproduktion von humanen hPSC – abgeleiteten PTEC geeignete Technologie.