Entwicklung einer proteomischen Anwendung für die Analyse multiresistenter bakterieller Isolate in der mikrobiologischen Diagnostik

Abstract

Multiresistente Erreger stellen laut WHO (World Health Organization) eine der 10 größten gesundheitlichen Bedrohungen der Menschheit dar [5-7]. Die effiziente Bekämpfung dieser Erreger ist von höchster Wichtigkeit für den Erhalt der modernen Medizin [8]. Dies kann durch eine genaue Erregeridentifizierung in Kombination mit rationaler Nutzung von Antibiotika erreicht werden. Um eine effiziente antimikrobielle Behandlung zu gewährleisten, ist neben der Resistenzbestimmung auch die Speziesbestimmung erforderlich. Momentan gibt es keine Methode in der klinisch-mikrobiologischen Diagnostik, die beides vereint. In der letzten Dekade kam es in der molekularen klinischen Diagnostik zu einigen revolutionären Entwicklungen. Darunter die Etablierung der „Matrix-assisted laser desorption ionisation time-of-flight-Massenspektrometrie“, kurz MALDI-TOF MS, welche eine schnelle, genaue und kostengünstige Speziesbestimmung in Kombination mit hohem Probendurchsatz ermöglicht [9, 10]. Diese wird mit molekularen Methoden wie der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erweitert, z.B. um antimikrobielle Resistenzen (AMR) zu detektieren. In der Regel werden jedoch weiterhin phänotypische Tests, wie die Antibiotika-Empfindlichkeitsprüfung (AST) zur Resistenzbestimmung durchgeführt, welche zeitaufwendig sind. Molekulare Detektionen sind schon länger Kandidaten in der klinischen-mikrobiologischen Diagnostik, vor allem um Protokolle zu ersetzen welche zusätzliche Schritte wie eine Anreicherung durch Anzucht oder sekundäre Inkubationen mit Antibiotika benötigen. Proteomik mittels Tandem- Massenspektrometrie gekoppelt an eine Flüssigchromatographie (LC-MS/MS) ist eine solche Technologie. Es wurde bereits gezeigt, dass die Detektion von Resistenzen durch die Analyse des Proteoms mittels LC-MS/MS möglich ist [11-15]. Der in dieser Arbeit entwickelte LC-MS/MS Workflow (rawDIAtect) ist in der Lage, die beiden wichtigsten Fragen der klinischen Mikrobiologie, nämlich Spezies- und Resistenzbestimmung, mittels Nutzung einer Methode zu beantworten und hat zudem das Potential auch weitere Fragestellungen, wie die Quantifizierung von Virulenzfaktoren, etwa von Toxinen, zu beantworten [16]. Der Workflow kann in weniger als einer 1 Stunde einen vollständigen Bericht über die Spezies sowie das Resistenzspektrum eines Isolates liefern. Die Kombination von LC-MS1-Daten zur Speziesbestimmung und der Einsatz von DIA-Auswertemethoden zur Resistenzbestimmung ist momentan einzigartig für die klinische MS-basierte Diagnostik. Anders als bei bisherigen Protokollen werden bei rawDIAtect nicht nur einzelne Antibiotikaresistenzen detektiert, sondern das gesamte Proteom aufgenommen. Der 1h- rawDIAtect-Workflow weist für ein Panel von 147 Bakterienisolaten bestehend aus 10 Gram- negativen sowie 2 Gram-positiven bakteriellen Spezies mit 30 AMR-Determinanten eine Sensitivität von 93 % und eine Spezifität von 99,3 % auf. Damit ist rawDIAtect ein vielsprechender Kandidat, die bakterielle Diagnostik Einzug zu finden.

According to the WHO (World Health Organization), multidrug-resistant pathogens are one of the 10 greatest threats to humanity [5-7]. The concrete and efficient control of these pathogens is of paramount importance for the preservation of modern medicine [8]. This can be achieved through accurate pathogen identification combined with rational use of antibiotics. To ensure efficient antimicrobial treatment, species identification is required in addition to resistance determination. Currently, there is no method in routine diagnostics that combines both. The last decade has seen some revolutionary developments in molecular clinical diagnostics. These include the establishment of "matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry", or MALDI-TOF MS for short, which enables rapid, accurate and cost- effective species determination in combination with high sample throughput [9, 10]. This is extended with molecular methods such as polymerase chain reaction (PCR) to detect antimicrobial resistance (AMR). However, phenotypic tests such as antibiotic susceptibility testing (AST) are usually carried out further to determine resistance, which are time- consuming. Molecular detection has long been a candidate in clinical diagnostics, especially to replace protocols that require additional steps such as enrichment by culturing or secondary incubations with antibiotics. Proteomics using tandem mass spectrometry coupled to liquid chromatography (LC-MS/MS) is one such technology. It has already been shown that the detection of resistance is possible by analysing the proteome using LC-MS/MS [11-15]. The LC-MS/MS workflow (rawDIAtect) developed in this work is able to answer the two most important questions in clinical microbiology, namely species and resistance determination, using one method and also has the potential to answer further questions, such as the quantification of virulence factors, for example of toxins [16]. The workflow can provide a complete report on the species as well as the resistance spectrum of an isolate in under 1 h. The combination of LC-MS1 data for species identification and the use of state-of-the-art DIA evaluation methods for resistance determination is currently unique for clinical MS-based diagnostics. Unlike previous protocols, rawDIAtect not only detects individual antibiotic resistances, but also the entire proteome. The 1h-rawDIAtect workflow has a sensitivity of 93 % and a specificity of 99.3 % for 30 AMR determinants for a panel of 147 bacterial isolates across 10 Gram-negative and 2 Gram-positive bacterial species. This makes rawDIAtect a promising candidate to enter the field of bacterial diagnostics.