Hypothermie zur Neuroprotektion nach hypoxisch-ischämischer Schädigung durch Regulation des Kälteschockproteins RBM3: eine Zellkulturstudie mit neuronalen Zellen

Abstract

Einleitung: Therapeutische Hypothermie (TH) ist die älteste etablierte Therapie zur Neuroprotektion im Rahmen einer hypoxisch-ischämischen Hirnschädigung. Ein genaueres Verständnis der Mechanismen der Neuroprotektion ist dringend erforderlich sowie Schlüssel zur Entwicklung alternativer oder synergistischer Therapien. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es die Effekte von TH in zwei in vitro Modellen, einer direkten Co-Kultur aus Neuronen und Mikrogliazellen und separaten Monokulturen aus primären hippocampalen und corticalen Neuronen, einer hypoxisch-ischämischen Hirnschädigung zu untersuchen. Insbesondere die Rolle von RBM3 soll betrachtet werden. Zusätzlich sollen die Wirkstoffe DADLE und WIN‑55,212‑2 auf ihre neuroprotektiven und synergistischen Effekte mit TH getestet werden. Methoden: Die neuronalen HT‑22 und mikroglialen BV‑2 Zellen wurden in eine direkte Co‑Kultur gebracht. Eine Oxygen-Glukose-Deprivation (OGD) und simulierte Reperfusion (OGD/R) wurden mittels einer 6‑stündigen Inkubation in Mangelmedium bei 0,2% O2 gefolgt von einer 24‑stündigen Kultivierung in Vollmedium bei 21% O2 induziert. Die Kulturen wurden in eine normotherme (37°C) und TH (33,5°C nach 3h OGD) Versuchsgruppe geteilt. DADLE und WIN‑55,212‑2 wurden jeweils für den 6‑stündigen OGD-Zeitraum appliziert. Zelltod und RBM3 Proteinexpression wurden mittels LDH Assay und Western Blot untersucht. Die Ergebnisse wurde in murinen primären corticalen und hippocampalen Neuronenkulturen, die einer 24‑stündigen OGD gefolgt von einer 24‑stündigen OGD/R ausgesetzt wurden, wiederholt. DADLE wurde für den OGD Zeitraum appliziert, während die Kühlung für den gesamten Versuchszeitraum induziert wurde. Es wurde ebenfalls ein LDH Assay durchgeführt, sowie die RBM3 Gen- und Proteinexpression mittels RT-qPCR und Western Blot analysiert. Ergebnisse: TH schützt die HT‑22/BV‑2 Co‑Kultur vor einer Schädigung durch OGD/R, gemessen an der LDH Freisetzung der Zellen, wobei der Effekt mit einer Induktion der RBM3 Proteinexpression einhergeht. DADLE allein, sowie DADLE plus TH sind ebenfalls protektiv. Die alleinige Applikation von DADLE führt, im Gegensatz zur Kombination mit TH nicht zu einer Zunahme der RBM3 Proteinexpression. WIN‑55,212‑2 reduziert nur in Kombination mit TH den Zelltod, wobei der Effekt den der alleinigen TH nicht übersteigt und nicht mit einer Induktion des RBM3 Proteins einhergeht. In primären hippocampalen Neuronen schützt nur die Kombination aus TH und DADLE vor der OGD/R Schädigung und ist mit einer früheren Translation der induzierten RBM3 mRNA in Protein assoziiert. Schlussfolgerung: TH schützt neuronale Zellen vor Zelluntergang durch OGD/R und führt zu einer Induktion der RBM3 Gen- und Proteinexpression. Die Substanz DADLE zeigt ein potentes neuroprotektives Potential und ist mit RBM3-unabhängigen Mechanismen sowie einer früheren Translation der RBM3 mRNA assoziiert. WIN‑55,212‑2 ist nur in Kombination mit TH protektiv und supprimiert die Hypothermie-induzierte Hochregulation der RBM3 Proteinexpression.

Introduction: Therapeutic hypothermia (TH) is the oldest established therapy to attenuate hypoxic/ischemic brain injury. A better comprehension of the underlying mechanism is required and essential for the development of alternative and synergistic therapies. The aim of this study was to investigate the effects of TH in two different in vitro models, including a direct co-culture of neurons and microglia and separate mono-cultures of primary hippocampal and cortical neurons, exposed to simulated hypoxic/ischemic injury. Specifically, the role of the cold-shock protein RBM3 was examined. Furthermore, the neuroprotective potential of the substances DADLE and WIN‑55,212‑2 as well as their additive and synergistic effects with TH were evaluated. Methods: A direct co-culture of HT‑22 neuronal and BV‑2 microglial cells was established to investigate oxygen-glucose deprivation (OGD) insult induced by exposure to 0.2% O2 in a glucose-serum free medium for 6h followed by 24h of replenished nutrients and oxygen simulating resuscitation (OGD/R). Experimental groups were further divided into normothermic (37°C) and hypothermic (33.5°C cooling after 3h of OGD) groups. DADLE and WIN‑55,212‑2 were separately applied during OGD. Cell viability and RBM3 expression was quantified by LDH release and Western blotting, respectively. The experiments were repeated in embryonic mouse primary hippocampal and cortical neuron cultures exposed to OGD for 24h followed by additional 24h of OGD/R. DADLE was applied at experimental start for the duration of OGD, whereas cooling was performed throughout the whole experiment in the respective groups. LDH was quantified using a LDH assay and RBM3 gene and protein expressions were assessed by Western blotting and RT-qPCR, respectively. Results: TH significantly reduced LDH release following OGD/R injury and is associated with an increase in RBM3 protein expression. Likewise, DADLE as well as the combination of DADLE and TH conferred cytoprotective effects. However, only the combinational application led to an upregulation of RBM3 expression. WIN‑55,212‑2 was only protective in combination with TH and suppressed the hypothermia-induced upregulation of RBM3. In primary hippocampal neurons, only the combination of TH and DADLE was protective and led to an earlier translation of RBM3 mRNA into protein. Conclusion: TH protects neuronal cells from hypoxic-ischemic brain injury with the effect possibly being mediated via an induction of RBM3 gene- and protein expression. DADLE has a potent neuroprotective potential and in combination with TH is associated with an earlier translation of RBM3 mRNA into protein. WIN‑55,212‑2 is only protective in combination with TH, although the hypothermia-induced RBM3 upregulation is suppressed.