The role of Osr1 in postnatal muscle development and muscle regeneration

Abstract

Myogenesis in development as well as during muscle regeneration involves a coordi- nated interplay of various cell and tissue types. Careful orchestration of immune cells, satellite cells, connective tissue and resident cell types is required for effective tissue repair. The muscle interstitium comprises various resident cell types such as intersti- tial fibroblasts, pericytes or fibro/ adipogenic progenitors (FAPs). While FAPs reside quiescent in the muscle interstitium in homeostatic tissue they are activated upon injury and provide a pro-myogenic environment necessary for regeneration. However, due to the lack of markers to particularly identify activated FAPs the clarification of exact underlying cell specific mechanisms is impeded, and a clear cell discrimi- nation challenging. FAPs are proposed as originating from mesenchymal cells, but confirmation remains elusive. Odd skipped related-1 ( Osr1 ) is expressed in muscle connective tissue derived from the lateral plate mesoderm during embryonic and fetal myogenesis in the limbs. Unpublished data demonstrate its crucial functional role for muscle patterning and contribution to muscle interstitial cells at the time of birth. However, postnatal ex- pression of Osr1 was not clear, and functional studies in the adult require a conditional Osr1 allele due to the lethality of a constitutive knock-out of Osr1 at early fetal stage. Here, the generation of two novel tools for investigating Osr1 expression in adult mice was performed. The Osr1 promotor- driven lacZ-reporter mouse model Osr1- MFA enables identification of Osr1+ cells by histological and immunohistochemical methods as well as by fluorescent-activated cell sorting (FACS) technique. The con- ditional line Osr1-flox carries a floxed allele of Osr1 thus allows for a conditional knock- out of Osr1 . Previous reports described a transient muscle interstitial cell population present during the first 3 weeks after birth, comprising myogenic non-satellite cell progenitors and juvenile FAPs. Here, expression of Osr1 in the FAP subpopulation is demonstrated which allows for specific identification of these cells in muscle tissue. Genetic lineage tracing demonstrated that these Osr1+ juvenile FAPs, at least in part, give rise to quiescent FAPs in adult muscle, where Osr1 expression is downregulated. These data contribute to the clarification of the origin of FAPs in the adult. Muscle damage triggers Osr1 expression in FAPs after cell activation, where it remains upregulated during the early phase of muscle regeneration. In a model of muscle injury that promotes fat formation, limited adipocytic contribution of Osr1+ FAPs was observed after lineage tracing. These data are in contrast to previous reports attributing a strong contribution of FACS isolated and engrafted FAPs to ectopic fatty accumulation. This highlights the importance of the tissue environment and the proneness of FAPs to external cues when removed from the tissue context. Moreover, in regenerated muscle the majority of FAPs had expressed Osr1 during the early phase of regeneration. These results provide evidence for Osr1 expression as a specific marker for activated FAPs after muscle injury. A large fraction of TCF4+ fibroblasts in regenerated muscle is derived from TCF4–/ Osr1+ FAPs. This observation elucidates TCF4+ fibroblasts as progenies of FAPs. A conditional knock-out of Osr1 after injury results in significantly reduced pro- inflammatory macrophage abundance and abnormal accumulation of aggregates in myofibers during an early stage of regeneration. These results suggest a functional involvement in the plasmin system. It is hypothesized that Osr1 indirectly regulates the conversion of plasminogen to plasmin, thus mediates extracellular matrix deposi- tion, macrophage recruitment and myofiber degeneration. This hypothesis assigns an essential role to Osr1 expression in FAPs for an effective muscle regeneration after injury.

Effektive Myogenese während der pränatalen Entwicklung wie auch während der Mus- kelregeneration bedarf eines koordinierten Zusammenspiels unterschiedlicher Zell- und Gewebstypen. Regeneration erfordert eine präzise funktionelle Abstimmung der Interaktionen zwischen Immunzellen, Satellitenzellen, Bindegewebe und residenten Zelltypen. Residente Zellarten im Muskelinterstitium umfassen interstitielle Fibrob- lasten, Perizyten und auch fibro/ adipogene Progenitoren (FAPs). FAPs befinden sich in quieszentem Zustand im Interstitium homöostatischen Muskelgewebes. Durch eine Muskelverletzung werden sie aktiviert, woraufhin sie im Laufe der Regeneration ein pro-myogenes Umfeld schaffen, welches für die Gewebsreparatur notwendig ist. Aus Ermangelung an Markern die spezifisch die Identifikation aktivierter FAPs ermöglicht, konnten deren exakte Funktionsmechanismen bislang nicht tiefgreifend geklärt wer- den. Der Ursprung von adulten FAPs wird in mesenchymalen Zellen vermutet, was jedoch noch nicht eindeutig bestätigt werden konnte. Odd skipped related-1 ( Osr1 ) wird während der embryonalen und fötalen Muskel- entwicklung der Extremitäten im Bindegewebe exprimiert, welches aus dem lateralen Plattenmesoderm entsteht. Unveröffentlichte Daten zeigen eine entscheidende funk- tionelle Rolle von Osr1 für die Musterbildung des Muskels. Desweiteren gehen aus embryonal Osr1 exprimierenden Zellen perinatal interstitielle Zellen hervor. Die Ex- pression von Osr1 in postnatalen Stadien ist bisher unklar. Eine Osr1 Defizienz ist letal im frühen fötalen Entwicklungsstadium. Dadurch werden funktionelle Studien zu Osr1 in erwachsenen Individuen erschwert, was jedoch mithilfe eines konditionellen Osr1 Allels ermöglicht werden könnte. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden zwei neuartige Werkzeuge zur Untersuchun- gen von Osr1 in adulten Mäusen generiert. Die Osr1-MFA Mauslinie exprimiert das Reportergen lacZ unter dem Osr1 Promotor, und ermöglicht so die Identifikation von Osr1+ Zellen für histologische und immunhistochemische Anwendungen, sowie für die Durchflusszytometrie (FACS). Das Mausmodell Osr1-flox trägt ein gefloxtes Osr1 Allel, womit ein konditioneller Osr1 Knock-out hervorgerufen werden kann. In vorhergehenden Veröffentlichungen wurde eine transiente muskelinterstitielle Zellpop- ulation beschrieben, welche ausschließlich in der juvenilen Phase der Maus, während der ersten 3 Wochen nach Geburt, detektiert werden kann. Diese Population umfasst myogene Progenitoren welche nicht der klassischen myogenen Linie entstammen, und juvenile FAPs, welche sich in ihrer Signatur von adulten FAPs unterscheiden. Im Rahmen dieser Arbeit kann eine spezifische Expression von Osr1 in dieser juvenilen FAP Subpopulation berichtet werden. Weiterhin kann durch genetisches Markieren und Verfolgen dieser Osr1+ juvenilen FAPs gezeigt werden, dass aus diesen adulte FAPs gebildet werden. Dadurch wird zum Verständnis über die Herkunft von adulten FAPs beigetragen. Osr1 wird in intaktem, homöostatischen adulten Muskelgewebe nur in vereinzel- ten FAPs experimiert. Die Verletzung von Muskelgewebe führt zu einer Aktivierung von FAPs, einhergehend mit einer Aktivierung von Osr1 Expression in diesen Zellen. Während der frühen Phase der Regeneration bleibt die Osr1 Expression hochreg- uliert. In einem Verletzungsmodell welches ektopische Fettbildung fördert wurde dabei nur eingeschränkt adipogenes Potenzial von Osr1+ FAPs in vivo beobachtet. Dies widerspricht vorangegangenen Berichten derer zufolge FAPs, welche zunächst aus ihrem Gewebszusammenhang isoliert, dann in ein identisches Verletzungsmodell transplantiert wurden, zu übermäßiger Fettbildung beitragen. Diese Diskrepanz unter- streicht die Bedeutung des Gewebszusammenhangs und verdeutlicht die Anfälligkeit von FAPs für äußere Einflüsse nach Entfernung aus diesem Zusammenhang. Ferner belegt die Expression von Osr1 in FAPs während der frühen Phase der Regeneration ihre Eigenschaft als spezifischer Marker für aktivierte FAPs nach Muskelverletzung. Damit konnte gezeigt werden, dass ein großer Anteil von TCF4+ Fibroblasten im regenerierten Muskel aus TCF4–/ Osr1+ FAPs hervorgeht. Diese Charakterisierung von aktivierten FAPs als Vorläufer von TCF4+ Fibroblasten trägt zum besseren Ver- ständnis über die Beziehungen interstitieller Zellpopulationen bei. Mithilfe des Osr1-flox Mausmodells wurde die Muskelregeneration nach kondi- tionellem Osr1 Knock-out untersucht. Osr1 Defizienz führt zu signifikant reduzierter Anzahl pro-inflammatorischer Makrophagen und abnormer Anhäufung intrazellulärer Aggregate in Muskelfasern während der frühen Phase der Regeneration. Diese Beobach- tungen lassen auf eine funktionelle Beteiligung am Plasmin System schließen. Osr1 könnte indirekt die Konversion von Plasminogen zu Plasmin Protease regulieren, und dadurch die Ablagerung von extrazelluärer Matrix, die Rekrutierung von Makrophagen und die Faserdegeneration im Zuge der Regeneration vermitteln. Diese Hypothese schreibt der Expression von Osr1 eine essenzielle Rolle für die Muskelregeneration nach Verletzung zu.