Klinische Variabilität und Expression des mutierten 657del5-Allels beim Nijmegen Breakage Syndrom

Abstract

Das Nijmegen Breakage Syndrom (NBS) ist eine autosomal rezessive Erkrankung. Patienten mit Nijmegen Breakage Syndrom haben ein erhöhtes Risiko an Neoplasien zu erkranken. Das NBS gehört zu den Chromosomenbruchsyndromen, NBS- Zellen weisen somit eine erhöhte Chromosomenbrüchigkeit und Strahlensensivität auf. Ursache für das NBS ist eine Mutation im NBN-Gen, welche zur Expression eines trunkierten Proteinfragments, genannt p70-Nibrin, führt. Dieses Proteinfragment wird in variierender Menge exprimiert. Die exprimierten p70-Nibrinmengen korrelieren mit der Inzidenz von Neoplasien. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Ursachen für Variationen der exprimierten p70-Nibrinmengen in Zellen von Patienten mit Nijmegen Breakage Syndrom zu indentifizieren. Als Ursache wurde initial das Wirken des Nonsense-mediated- mRNA-decay vermutet, da durch die das NBS verursachende 6575-Mutation ein vorzeitiges Stopcodon in den Leserahmen geschoben wird. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden mittels Real-Time PCR die NBN-mRNA von Patientenzellen quantifiziert, die hohe oder niedrige Mengen an p70-Nibrin exprimierten. Hierbei konnte keine Korrelation zwischen p70-Nibrin und NBN-mRNA festgestellt werden. Der Nonsense- enrichment-Index lag bei 1,27 und sprach somit gegen das Wirken des Nonsense-mediated-mRNA-decay. Des Weiteren wurden NBN-mRNA-Mengen von gesunden Individuen und deren p95-Nibrinwerte quantifiziert. Die Patientenzellen wiesen durchschnittlich sechzig Prozent der NBN-mRNA der Kontrollzelllinien auf, während ihre p70-Mengen etwa zwanzig Prozent der p95-Mengen der Kontrollzelllinien betrug. Es konnte keine Korrelation zwischen p70-Nibrin und p70-mRNA festgestellt werden. Somit konnten die ersten beiden Hypothesen widerlegt werden. Die Ursache der Variationen der exprimierten p70-Nibrinmengen ist nicht auf mRNA-Eben zu finden. In weiteren Untersuchungen wurde der proteasomale Abbau in NBN-Wildtyp- und NBS-Fibroblasten gehemmt und anschließend die Veränderung der p70-Nibrinmengen bzw. der p95-Nibrinmengen gemessen. Während die Nibrinmengen der Wildtypzellen konstant blieben, stiegen die Nibrinmengen in den NBS-Fibroblasten auf das 3,5 fache des Ausgangswertes an. Die Mengenunterschiede von Nibrin scheinen somit nicht durch variierende mRNA-Mengen hervorgerufen, sondern sie scheinen auf variierende Abbauraten des Nibrinmoleküls in verschiedenen Zellen rückführbar zu sein. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die p70-Nibrinwerte von 48 heterozygoten und von fünf homozygoten Individuen bestimmt, um die Heritabilität der p70-Nibrinmengen zu ermitteln. Die Individuen konnten Familien in acht Stammbäumen zugeordnet werden. Die Auswertung zeigte bei geringer Korrelation einen Anstieg der Regressionsgrade. Dieser Anstieg spräche grundsätzlich für eine Heritabilität. Die Werte sprechen für eine polygene Vererbung der p70-Nibrinmengen

Patients affected by the autosomal recessive Nijmegen Breakage Syndrome (NBS [MIM 251260]) have possibly the highest risk for developing a malignancy of all the chromosomal instability syndromes. This reflects the profound disturbance to genomic integrity and cellular homeostasis that is caused by the mutation of the essential mammalian gene, NBN. Whilst null-mutation of Nbn is lethal in the mouse, NBS patients survive due to the fact that the common human founder mutation, found in over 90% of patients, is in fact hypomorphic and leads, by alternative translation, to varying amounts of a partially functional carboxy-terminal protein fragment, p70-nibrin. The expression level of p70-nibrin correlates with cancer incidence amongst patients. Using real- time PCR we have now found that the variation in p70-nibrin expression cannot be attributed to differences in mRNA quantity and that nonsense-mediated mRNA decay is not responsible for the observed variation. We discuss an alternative explanation for p70-nibrin expression variation.