Stability and inactivation of hepatitis E virus at different physico-chemical treatments including pH, salt, high pressure and drying

Abstract

The hepatitis E virus (HEV) can cause acute or chronic liver inflammation in humans. In the last two decades, the numbers of notified hepatitis E cases have increased sharply, also in Germany. Here, the HEV genotype 3, which is also widespread in domestic pigs and wild boars, plays the most important role. For this genotype, the consumption of contaminated meat products from infected animals is assumed to be the main route of transmission. However, other transmission routes, such as via animal contact, contaminated surfaces or blood products, can also play a role. To assess the risk potential of specific foods and transmission routes, knowledge on the HEV stability and inactivation is an important prerequisite; however, this knowledge was largely missing at the beginning of the studies presented here. Therefore, the aim of the work was to determine basic data on the stability of HEV at different physico-chemical conditions such as pH, salt concentration, drying as well as a treatment with high pressure. Priority was given to investigate conditions, that are used in food production or that can be expected after contamination of surfaces, in order to be able to draw practical conclusions. For the investigations, HEV preparations in buffer solutions were subjected to the appropriate treatments and the residual infectivity was subsequently determined by cell culture cultivation and immunofluorescence analysis of viral proteins. After optimization of the method, virus amounts of approximately 104 infectious units per ml could be used, and their complete inactivation was considered as sufficient based on similar requirements for disinfectant testing. In the first study, the stability of HEV against different pH values was investigated. Here, it was determined that efficient inactivation after 3 hours of incubation at room temperature (RT) occurred only at pH 1 and pH 10, whereas the virus was stable against pH 2 - 9. Further experiments were performed with the addition of D/L-lactic acid in the range between pH 4.5 and 6.5, in order to simulate conditions during food production and preservation. Here, only a slight reduction in HEV infectivity was found after 7 days at RT, whereas no significant HEV infectivity reduction was detected at 4 °C under the same conditions compared to the respective control at pH 7.7. In the second study, the salt stability of HEV was investigated. At sodium chloride concentrations of up to 20%, no reduction in HEV infectivity was detected after 24 hours at RT compared to the control. Salt conditions, as used in meat preservation, also elicited only minor reductions in HEV infectivity after 6 days at RT or after 8 weeks at 16 °C compared to the respective control samples without salt addition. In the third study, the high pressure stability of HEV was investigated. Here, it was shown that HEV was almost completely inactivated after 2 minutes at 600 MPa, which represents the highest pressure commonly used for food preservation. Lower pressures resulted in smaller decreases in infectivity. Longer pressure holding times and lower temperatures resulted in stronger decreases in HEV infectivity. In the fourth study, the drying stability of HEV on different surfaces was investigated. Here, the infectivity of HEV decreased only slightly due to the drying process. During subsequent storage at RT and 26% relative humidity, complete HEV inactivation was achieved only after 8 weeks. At 3 °C and 98% relative humidity, very high HEV concentrations were still found on plastics after 8 weeks, followed by ceramics and steel, whereas the virus was completely inactivated on wood at this time point. It can be concluded from the results that HEV is very stable against physico-chemical treatments. Under conditions such as those prevailing in raw sausage production, HEV cannot be inactivated efficiently. Therefore, raw sausage products must be considered as potential source of infection. High pressure treatment of risk foods could be an effective measure to increase food safety. Since HEV is exceptionally stable after drying on surfaces, strict hygiene measures during food preparation and in the environment of patients are prerequisites for the interruption of infection chains. In summary, the obtained stability data provide basic insights into the properties of the HEV particle, which can be relevant for applied aspects in food production, but also for other areas such as medical products or hospitals.

Das Hepatitis E-Virus (HEV) kann beim Menschen eine akute oder chronische Leberentzündung hervorrufen. In den letzten zwei Jahrzehnten sind die Zahlen der gemeldeten Hepatitis E-Fälle unter anderem in Deutschland stark angestiegen. Hier spielt vor allem der HEV-Genotyp 3, der auch in Haus- und Wildschweinen weit verbreitet ist, die wichtigste Rolle. Für diesen Genotyp wird als Hauptübertragungsweg der Verzehr von kontaminierten Fleischprodukten aus infizierten Tieren angenommen. Aber auch andere Übertragungswege, beispielsweise über Tierkontakt, kontaminierte Oberflächen oder Blutprodukte, können eine Rolle spielen. Zur Beurteilung des Risikopotenzials spezieller Lebensmittel und Übertragungswege sind Kenntnisse zur Stabilität und Inaktivierung des HEV eine wichtige Voraussetzung, die aber zu Beginn der hier vorgestellten Studien noch weitgehend fehlten. Ziel der Arbeit war deshalb die Ermittlung grundlegender Daten zur Stabilität von HEV gegenüber verschiedenen physiko-chemischen Einflussfaktoren wie pH-Wert, Salzkonzentration, Trocknung sowie eine Behandlung mit Hochdruck. Hierbei sollten vorrangig Bedingungen untersucht werden, die in der Lebensmittelherstellung zur Anwendung kommen oder nach Kontamination von Oberflächen zu erwarten sind, um praxisnahe Schlussfolgerungen ziehen zu können. Für die Untersuchungen wurden HEV-Präparationen in Pufferlösungen den entsprechenden Behandlungen unterzogen und anschließend die Restinfektiosität mittels Zellkulturanzüchtung und Immunfluoreszenzanalyse viraler Proteine bestimmt. Nach Optimierung der Methode konnten Virusmengen von etwa 104 infektiösen Einheiten pro ml eingesetzt werden, deren vollständige Inaktivierung auf der Basis ähnlicher Vorgaben für die Desinfektionsmitteltestung als ausreichend bewertet wurde. In der ersten Studie wurde die Stabilität von HEV gegenüber verschiedenen pH-Werten untersucht. Hierbei wurde ermittelt, dass eine effiziente Inaktivierung nach 3 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur (RT) nur bei pH 1 und pH 10 erfolgte, während das Virus gegenüber pH 2 - 9 stabil war. Weitere Versuche wurden unter Zusatz von D/L-Milchsäure im Bereich zwischen pH 4,5 und 6,5 durchgeführt, um Bedingungen während der Lebensmittelherstellung und -konservierung zu simulieren. Hierbei ergab sich nur eine leichte Reduktion der HEV-Infektiosität nach 7 Tagen bei RT, während bei 4 °C unter den gleichen Bedingungen keine signifikante HEV-Infektiositätsreduktion im Vergleich zur jeweiligen Kontrolle bei pH 7,7 feststellbar war. In der zweiten Studie wurde die Salz-Stabilität von HEV untersucht. Bei Natriumchlorid-Konzentrationen von bis zu 20% konnte nach 24 Stunden bei RT keine Verringerung der HEV-Infektiosität im Vergleich zur Kontrolle festgestellt werden. Auch Salzkonditionen, wie sie bei der Fleischkonservierung Verwendung finden, riefen nach 6 Tagen bei RT bzw. nach 8 Wochen bei 16 °C nur geringfügige Verminderungen der HEV-Infektiosität gegenüber den jeweiligen Kontrollproben ohne Salzzusatz hervor. In der dritten Studie wurde die Hochdruck-Stabilität von HEV untersucht. Hierbei wurde gezeigt, dass HEV beim höchsten üblicherweise für die Lebensmittelkonservierung verwendeten Druck von 600 MPa für 2 Minuten fast vollständig inaktiviert wurde, während niedrigere Drücke zu geringeren Abnahmen der Infektiosität führten. Längere Druckhaltezeiten und niedrigere Temperaturen führten zu stärkerer Abnahme der HEV-Infektiosität. In der vierten Studie wurde die Trocknungsstabilität von HEV auf verschiedenen Oberflächen untersucht. Hierbei nahm die Infektiosität von HEV durch den Trocknungsprozess nur wenig ab. Bei der anschließenden Lagerung bei RT und 26% relativer Luftfeuchtigkeit wurde eine vollständige HEV-Inaktivierung erst nach 8 Wochen erreicht. Bei 3 °C und 98% relativer Luftfeuchtigkeit fanden sich nach 8 Wochen auf Plastik noch sehr hohe HEV-Konzentrationen, gefolgt von Keramik und Stahl, während das Virus auf Holz zu diesem Zeitpunkt vollständig inaktiviert war. Aus den Ergebnissen kann geschlussfolgert werden, dass HEV sehr stabil gegenüber physiko-chemischen Einflussfaktoren ist. Unter Bedingungen, wie sie beispielsweise bei der Rohwurstherstellung vorherrschen, kann HEV nicht effizient inaktiviert werden, weshalb Rohwurstprodukte als potentielle Infektionsquelle angesehen werden müssen. Eine Hochdruck-Behandlung von Risikolebensmitteln könnte eine wirksame Maßnahme zur Erhöhung der Lebensmittelsicherheit darstellen. Da HEV nach Trocknung auf Oberflächen außerordentlich stabil ist, sind strikte Hygienemaßnahmen bei der Lebensmittelzubereitung und in der Patientenumgebung Voraussetzung für eine Unterbrechung von Infektionsketten. Zusammenfassend geben die ermittelten Stabilitätsdaten grundlegende Einblicke in die Eigenschaften des HEV-Partikels, die für anwendungsorientierte Aspekte in der Lebensmittelproduktion, aber auch für andere Bereiche wie Medizinprodukte oder Krankenhäuser, von Bedeutung sein können.