Induktion der Apoptose der Melanomzellen nach Dipeptidylpeptidase IV/ CD26-Expression

Abstract

Die DPPIV/CD26 zeigt ein ubiquitäres Vorkommen als integrales Typ II Membranprotein sowie in löslicher Form in Körperflüssigkeiten. Neben ihrer Serinproteaseaktivität wurde eine Multifunktionalität im Rahmen der Immunmodulation, neuer Möglichkeiten in der Therapie des Diabetes mellitus Typ II, als Zelladhäsionsmolekül und als ein wichtiger Faktor in der Tumorgenese epithelialer und lymphatischer Malignome beschrieben. Eine in Melanozyten vorhandene DPPIV-Expression ist in Melanomen reduziert bzw. lässt sich nicht mehr nachweisen. Vorherige Untersuchungen legen den Schluß nahe, daß die DPPIV-Expression in Malignomen epithelialen Ursprungs mit dem Grad der Differenzierung der transformierten Zellen korreliert. Ziel der hier dargestellten Untersuchungen war es den Einfluß der DPPIV-Expression in Melanomen auf die Apoptose zu studieren. Weiterhin wurden richtungsweisende Versuche der DPPIV-Expression in Melanomen und deren Einfluß auf die Zellmatrixadhäsion durchgeführt. Die Apoptosemessungen erfolgten nach Propidiumjodid-Anfärbung und AnnexinV-Markierung im FACS. In Mel2A Melanomzellen führte die rDPPIV-Expression unter normalen Kulturbedingungen zu einer gesteigerten Apotose. Mit 72 h Serumentzug und nach rDPPIV-Expression ließ sich gegenüber parentalen Zellen eine Zunahme der Apoptoserate von 5% auf 38% nachweisen.In Zellzyklusuntersuchungen kam es nach DPPIV-Expression zu einer Abnahme der G2/M-Phase und zu einem Arrest der Zellen in der G1/G0-Phase. Zur besseren Steuerbarkeit der DPPIV-Expression erfolgte die Etablierung einer Doxycyclin-induzierbaren hDPPIV-Expression (pTet-On/pTRE2) in 303AG7 Melanomzellen. Hierzu wurde zunächst die hDPPIV cDNA in das pTRE2-Antwortplasmid kloniert und anschliessend in 303AG7 Melanomzellen, mit pTet-On-Regulationsplasmid stabil transfizierte BRO, transfiziert. In 303AG7 zeichnete sich nach hDPPIV-Expression eine Zunahme der Zelladhäsion auf Fibronektin und Kollagen IV ab. Zusammenfassend kommt es nach Wiederherstellung der DPPIV-Expression in Mel2A Melanomzellen zu einer Zunahme der Apoptoserate mit einem Zellzyklusarrest in der G1/G0-Phase. Zukünftige Untersuchungen gelten mechanistischen Analysen hinsichtlich der Apoptose. Welchen Einfluß haben Wechselwirkungen zwischen DPPIV und Zellmatrixproteinen auf die Differenzierung und die Metastasierung?

DPPIV/CD26 shows an ubiquitary occurrence as a type II membrane protein as well as the soluble form in body fluids. Beside its serineprotease activity, its multifunctionality in sense of immunomodulation, new potentials in the therapy of diabetes mellitus type II, as well as cell adhesion and an important factor in the tumorgenesis of epithelial and lymphatic malignomas has been described. The expression of DPPIV in melanocytes is reduced in melanoma cells to a rather undetectable level. Previous investigations lead to the conclusion that DPPIV-expression in malignomas of epithelial origin correlates with the level of differentiation of the transformed cells. The aim of the shown investigations was to study the influence of DPPIV-expression in melanoma with respect to apoptosis. Furthermore, trend-setting experiments with DPPIV-expression in Melanoma and its influence on the cell-matrix adhesion were accomplished. The measurement of apoptosis was done by using FACS-analysis after staining with propidiumiodide and Annexin V. Under normal cellculture conditions rDPPIV-Expression in Mel2A melanoma cells lead to an increase in apoptosis. After 72 hours of serum withdrawal Mel 2A cell showing rDPPIV-expression lead to an improvement of apoptosis from 5% to 38% in cotrast to parental Mel2A cells. Cell cycle experiments showed a reduction of the G2/M-Phase and a cell arrest in the G1/G0-phase after rDPPIV-expression. In order to control DPPIV-expression a doxycylin inducible hDPPIV-expression system (pTet-On/pTRE2) was established in 303AG7 melanoma cells. Therefore hDPPIV cDNA was cloned into the pTRE2-response plasmid and subsequently transfected into 303AG7 melanoma cells, a subclone of BRO-pTet-On regulation plasmid stable transfectants. After hDPPIV-Expression in 303AG7 an augmentation of cell adhesion on fibronectin and collagen IV became apparent. In conclusion, the restoration of rDPPIV-expression in Mel2A melanoma cells resulted to an increase in apoptotic rate as well as a cellcycle arrest in the G1/G0-phase. It is of great importance to further investigate the role of DPPIV in apoptosis and its delaying mechanism as well as the role in cell- matrix adhesion and its relationship to differentiation and metastasis.