Die Effekte von Östrogen auf den Proteingehalt, die Lokalisation und Funktion von Sirt1 in humanen Makrophagen

Abstract

Kardiovaskuläre Erkrankungen stellen weltweit eine der häufigsten Todesursachen dar. Die Rolle des weiblichen Geschlechtshormons Östrogen (E2) bei kardiovaskulären Erkrankungen wird in zahlreichen Studien kontrovers diskutiert. Die möglichen protektiven Effekte von E2 bei der Entwicklung der Atherosklerose sind unter anderem zurückzuführen auf die Wirkung von E2 auf Chemokine und Zytokine, welche am frühentzündlichen Prozess der Atherosklerose beteiligt sind. Eine wichtige Rolle im Rahmen dieser entzündlichen Prozesse spielen die mononukleären Abwehrzellen Makrophagen. Ein potentielles Zielprotein für Östrogen ist die NAD+-abhängige Deacetylase Sirt1. Es wurde postuliert, dass ihre Aktivität durch die Östrogen-Rezeptor-Subtypen alpha and beta moduliert wird. Eine Aktivitätszunahme von Sirt1 führt im Nukleus zur Deacetylierung der Proteine p53, Ku70 und NFκB. Die Effekte von E2 auf die Proteinmenge und Funktion von Sirt1 in humanen Zellen sind bisher wenig erforscht. Daten über die E2-Sirt1-Interaktion in humanen Zellen wurden hauptsächlich in pathologischen Zellen akquiriert, bspw. in Brustkrebs-Zelllinien. In dem vorliegenden Projekt sollte untersucht werden, ob E2 einen Einfluss auf den Sirt1-Gehalt und die Sirt1-Aktivität in humanen Makrophagen hat, gemessen anhand des Acetylierungsgrades der nukleären Proteine p53 und Ku70. Weiterhin sollte der Effekt von E2 auf die Lokalisation von Sirt1 in der humanen Makrophagen-Zelllinie THP1 untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass eine Behandlung mit E2 keinen Effekt auf den Proteingehalt von Sirt1 im Vollzelllysat von primären humanen M1-Makropagen hat, wohingegen die Acetylierung der nukleären Proteine p53 in weiblichen sowie Ku70 in weiblichen und männlichen M1-Makrophagen erhöht ist. Die Menge des zytosolischen Sirt1-Zielproteins NFκB-p65 zeigt sich in männlichen M1-Makrophagen unter Stimulation mit E2 erhöht, während in weiblichen M1-Makrophagen kein E2-Effekt nachweisbar ist. Um die Effekte von E2 in den einzelnen Zellkomponenten genauer zu eruieren, erfolgte eine Nukleusisolation mit der humanen monozytären Zelllinie THP1, da eine Isolation der nukleären Fraktion in primären humanen Zellen nicht möglich war. In THP1-Zellen zeigte sich unter Stimulation mit E2 ein signifikanter Abfall des Sirt1-Gehaltes in der nukleären Fraktion sowie eine signifikante Steigerung der Ku70-Acetylierung, wohingegen die Sirt1-Menge und Ku70-Acetylierung im Vollzelllysat unverändert blieb. Zusammenfassung: Die Ergebnisse der Versuche führten zu der Hypothese, dass die vermehrte Acetylierung der nukleären Proteine p53 und Ku70 bei unveränderter Sirt1-Proteinmenge im Vollzelllysat auf einen verminderten nukleäre Sirt1-Gehalt zurückzuführen ist.

Cardiovascular diseases severely contribute to death and disability worldwide, with the male sex as a major risk factor. The role of the female sex hormone estrogen (E2) in cardiovascular diseases has been discussed controversially in several studies. The potential protective effects of estrogen in the development of atherosclerosis is, amongst others, due to the effect of E2 on chemokines and cytokines, which are involved in the early-inflammatory process of atherosclerosis. The mononuclear immune cell macrophages figure prominently in the inflammatory process. One potential target protein of E2 is the NAD+-dependent deacetylase Sirt1, its amount seems to be modulated by the estrogen receptor subtypes alpha and beta. An increased activity of Sirt1 leads to deacetylation of the proteins p53, Ku70 and NFκB in the nucleus. The effects of E2 on protein levels and function of Sirt1 in human cells have been poorly investigated. Data on E2-Sirt1 interaction in human cells have mainly been acquired in pathological cells, e.g., breast cancer cell lines. This study attempted to show the effects of E2 on the amount and activity of Sirt1 in human macrophages, measured by the level of acetylation of the nuclear proteins p53 and Ku70. Furthermore, the effects of E2 on the localization of Sirt1 were investigated in the human monocytic cell line THP1. A stimulation with E2 in primary human macrophages showed no effects on the protein amount of Sirt1 in full cell lysate, whereas the nuclear proteins p53 in female and Ku70 in female and male macrophages showed an increase of acetylation. The amount of the cytosolic Sirt1-target-protein NFκB-p65 was increased in male macrophages during stimulation with E2, whereas no effect could be seen in female macrophages. To investigate the effects of E2 in the individual cell components in more detail, nucleus isolation was performed using the human monocytic cell line THP1, since isolation of the nuclear fraction in primary human cells was not possible. In THP1-cells with E2 stimulation, a significant decrease of Sirt1 amount was detected in the nuclear fraction as well as an increase of Ku70-acetylation. In contrast, the Sirt1 amount in the full cell lysate remained unchanged. Conclusion: The results of the experiments led to the hypothesis that the increased acetylation of nuclear proteins p53 and Ku70 with unchanged Sirt1 protein levels in whole cell lysate was due to decreased nuclear Sirt1 levels.