Evaluation of human umbilical cord Wharton’s Jelly Cells as a potential cell source for cardiovascular tissue engineering

Abstract

Evaluation of cell sources is a crucial requirement for a successful tissue engineering process. Given that biopsies from heart valves are not available for cardiovascular tissue engineering, an alternative cell source with high analogy to native heart valve cells has to be evaluated. Tissue engineering, however, requires millions of cells, i.e. human mesenchymal stem cells, and the umbilical cord is a natural source of such pluripotent cells. The mucoid connective tissue in umbilical cord, known as Wharton’s jelly (WJ), is a rich source of mesenchymal stem cells (MSC). The collection of stem cells from WJ is a non-invasive process and, importantly, carries no ethical concerns. Isolation of a maximum number of cells from the source and increasing the number of cells without losing their prime quality are important steps toward the successful tissue engineering of heart valves and blood vessels. The mesenchymal stem cells from WJ are believed to be fibroblast-like and could be used therefore as a supporting and matrix building structure during the generation of new tissue in vitro. In the present study, cells were isolated using an explant technique that has recently been shown to retain cell morphology and structure. Isolated cells showed plastic adherence in standard culture conditions (first minimal criterion of human MSC (hMSC)). Qualitative analysis revealed that the WJ cells were positive for CD29, CD90 and CD105 but negative for CD34, CD45 and CD117, indicating that they are not of hematopoietic origin (second minimal criterion of hMSC). These cell surface markers are the same as those expressed by bone marrow stem cells, suggesting that the WJ adherent cells that were isolated do indeed have stem cell properties. Qualitative analysis of these properties of unstimulated WJ cells was maintained consistently during passaging until Passage 5 and no difference was shown between Passage 1 and Passage 5 cells. Directly after cryopreservation and thawing the viability of the cells decreased significantly but recovery occurred quickly in Passage 1. The remaining viable cells were successfully expanded until Passage 5 without showing morphological differences but with differences in proliferation potential. Although appropriate stimulated WJ cells could differentiate into osteogenic, chondrogenic and adipogenic cells, in a recent comparative study it was found that bone marrow cells showed greater efficiency. The findings of the present work are evidence that multipotent umbilical cord mesenchymal stem cells are present in the WJ of the human umbilical cord (minimal criteria for hMSC). A distinct feature of WJ is its perivascular, inter-vascular and subamnion regions that could potentially develop into distinct cell populations. The unstimulated WJC were easy to obtain and expressed characteristics related to fibroblasts and, in addition to this, pluripotent characteristics, making them attractive for cardiovascular tissue engineering, in particular the matrix building structure of these cell types. Hence it is important to understand the characteristics of this cell population for their use in therapeutic purposes, i.e. in the tissue engineering of human heart valves and other cardiovascular tissues.

Die Evaluierung geeigneter Zellquellen ist ein essentieller Bestandteil für einen erfolgreichen Tissue Engineering Prozess. Da keine nativen Biopsien von Herzklappen für das kardiovaskuläre Tissue Engineering zur Verfügung stehen, muss eine alternative Zellquelle mit einer hohen Ähnlichkeit zu den nativen Herzklappenzellen evaluiert werden. Für das Tissue Engineering werden Millionen Zellen benötigt, z.B. mesenchymale Stammzellen und daher bietet sich die Nabelschnur als natürliche Quelle für diese pluripotenten Zellen an. Das mukoide Bindegewebe in der Nabelschnur, auch als Wharton'sche Sulze beschrieben, ist eine Quelle reich an mesenchymalen Stammzellen. Die Gewinnung von Stammzellen aus der Wharton´schen Sulze ist ein nicht-invasiver Prozess und, was besonders wichtig ist, birgt keinerlei ethische Bedenken. Standardisierte Isolationstechniken zur Gewinnung maximaler Zellzahlen aus der Quelle und die ansteigende Zahl der Zellen, die nicht ihre Spitzenqualität verlieren, sind entscheidende Schritte für ein erfolgreiches Tissue Engineering von Herzklappen und Blutgefäßen. Mesenchymale Stammzellen aus der Wharton'schen Sulze werden als fibroblastoide Struktur betrachtet und könnten als Gerüst- und Matrixgebende Struktur während der in vitro Entwicklung neuen Gewebes verwendet werden. In der gegenwärtigen Arbeit wurden Zellen mittels „Explant-Methode“ isoliert, welche gezeigt hat, dass sowohl die Zellmorphologie als auch die Struktur beibehalten wird. Isolierte Zellen weisen die Fähigkeit zur plastischen Anhaftung in standardisierten Kulturbedingungen aus, das erste Minimalkriterium für humane mesenchymale Stammzellen. Qualitative Analysen zeigten, dass Zellen der Wharton´schen Sulze positiv für CD29, CD80 und CD150, jedoch negativ für CD34, CD45 und CD117 sind, was beweist, dass sie nicht hämatopoetischen Ursprungs sind (zweites Kriterium für humane mesenchymale Stammzellen). Die genannten Oberflächenmarker sind dieselben wie diejenigen, die auf Knochenmarkstammzellen exprimiert werden, was vermuten lässt, dass die isolierten, adhärenten Zellen der Wharton´schen Sulze Stammzelleigenschaften besitzen. Qualitative Analysen der Eigenschaften der nicht-stimulierten Zellen aus der Wharton´schen Sulze blieben stabil während der Passagen 1 bis 5 erhalten und es wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen diesen Passagen beobachtet. Direkt nach der Kryokonservierung und dem Auftauen verringerte sich die Vitalität der Zellen, eine Erholung fand jedoch schnell in Passage 1 statt. Die verbliebenen vitalen Zellen wurden erfolgreich vermehrt bis Passage 5 ohne Unterschiede in der Morphologie aber mit Wachstumspotentialunterschied im Vergleich zu frischen Zellen. Obwohl sich Zellen der Wharton'schen Sulze generell unter geeigneten, stimulierenden Bedingungen in osteogene, chondrogene und adipogene Zellen differenzieren ließen, konnte in einer Vergleichsstudie gezeigt werden, dass Knochenmarkzellen einen höheren Differenzierungsgrad aufwiesen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten, dass multipotente mesenchymale Stammzellen in der Wharton'schen Sulze der Nabelschnur vorhanden sind (Minimalkriterium für humane mesenchymale Stammzellen). Ein ausgeprägtes Merkmal der Wharton'schen Sulze ist ihre perivaskuläre, intervaskuläre und subamniale Zone, welche sich potentiell in verschiedene Zellpopulationen entwickeln kann. Nicht-stimulierte Zellen der Wharton'schen Sulze waren einfach zu gewinnen und exprimierten Eigenschaften ähnlich denen von Fibroblasten und zusätzlich dazu auch pluripotente Eigenschaften, welche sie für das kardiovaskuläre Tissue Engineering attraktiv machen, insbesondere die gerüstgebende Struktur dieser Zellen. Daher ist es wichtig die Charakteristika dieser Zellpopulationen zu verstehen mit Hinblick auf ihre Verwendung für therapeutische Zwecke, z.B. für das Tissue Engineering humaner Herzklappen und anderer kardiovaskulärer Gewebe.