Inhibierung von Adenovirusinfektion mittels siRNA vermittelter Blockade adenoviraler Regulations- und Verpackungsgene

Abstract

Adenoviren gelten allgemein als Verursacher milder gastrointestinaler und respiratorischer Infektionen sowie von Infektionen der Konjunktiven. In jüngerer Zeit haben sie jedoch zunehmend als Pathogene an Bedeutung gewonnen. So wurden Adenoviren beispielsweise als Verursacher der viralen Myokarditis isoliert. Des Weiteren ist eine Vielzahl von Fällen berichtet worden, in denen Infektionen mit Adenoviren bei immunsupprimierten Patienten, darunter häufig Kinder, zu fulminanten Verläufen mit nicht selten letalem Ausgang führten. Dennoch gibt es bisher keine suffiziente, allgemein anwendbare anti- adenovirale Therapie. Das posttranskriptionelle Gen-Silencing mittels RNA- Interferenz (RNAi) konnte in den letzten Jahren als potenter und vielversprechender Ansatz zur antiviralen Therapie etabliert werden. Dabei vermitteln kurze doppelsträngige RNA-Moleküle, die small interfering RNAs (siRNAs), im Zytoplasma die Bindung ihrer sequenzhomologen Ziel-mRNA und die darauffolgende enzymatische Spaltung. An vielen Beispielen wurde bereits gezeigt, dass sich virale Infektionen durch den Einsatz von synthetisch hergestellten siRNAs oder den verwandten shRNAs (short-hairpin RNAs) effizient inhibieren lassen. Darunter auch bedeutende humanpathogene Viren wie das Hepatitis C Virus, das Hepatitis B Virus oder das HI-Virus. In der vorliegenden Arbeit wurde in vitro untersucht inwieweit sich die Infektion mit Adenovirus Typ 5 durch siRNAs gegen die adenoviralen Gene E1A, Hexon und IVa2 inhibieren lässt. Initial wurde dazu unter vier verschiedenen gegen jedes Zielgen vorliegenden synthetischen siRNAs die effizienteste evaluiert und weiteren Analysen zugeführt. Die sequenzspezifische Wirkung der siRNAs konnte in einem nächsten Schritt nachgewiesen werden. In der vergleichenden Untersuchung der siRNAs zeigten die siRNAs gegen die späten adenoviralen Gene, siHexon und siIVa2, ein deutlich stärkeren inhibitorischen Effekt auf die adenovirale Replikation als die siRNA gegen das frühe Gen E1A, vor allem da sie bereits in niedriger Dosierung effizient wirkten. Kombinationen von siHexon und siIVa2 zeigten zwar additive Effekt, führten jedoch bei dosisäquivalentem Einsatz nicht zu einer verstärkten Inhibierung der adenoviralen Replikation im Vergleich mit Einzelkomponenten. Überraschenderweise konnten bei Betrachtung des zytopathischen Effekts hingegen nur die Kombinationen aus siE1A und siHexon bzw. siIVa2 die Adenovirus vemittelte Zelllyse effizient inhibieren und einen zytoprotektiven Effekt demonstrieren. Eine Kombination aus den siRNAs gegen das frühe Gen E1A und den siRNAs gegen die späten Gene Hexon bzw. IVa2 ist folglich in Bezug auf den anti-adenoviralen Effekt insgesamt überlegen gegenüber der einzelnen Applikation der siRNAs.

Adenoviruses are generally referred to as mild pathogens for they are commonly known as causative agents of mild respiratory infections of the upper airways, common gastrointestinal infections or conjunctivitis. Anyhow in younger times Adenoviruses gained a certain attention by having been determined as one of the main pathogens to cause viral myocarditis as well as having been reported to induce severe infections of liver and lung in the immunocompromised patient often taking a fulminant course and leading to subsequent death. Nevertheless there is currently no curative and specific pharmaceutical approach to treat Adenovirus infection. Gene Silencing by RNA Interference (RNAi) however has been shown to be a potent tool in treatment of viral infections as has been proven in principle for example for HC-, HB- and HI-Virus. The goal of the present thesis therefore was to examine the potential of RNAi-mediated inhibition of Adenovirus 5 infection by the use of small interfering RNAs (siRNAs) targeting both early (E1A) and late (IVa2 and Hexon) adenoviral genes. Several of the initially analyzed siRNAs directed against E1A, IVa2 and Hexon showed a distinct antiviral activity. Further investigations were performed to select the most effective siRNAs against each target. In a next step comparative analysis was conducted. The siRNAs against late adenoviral genes proved to be more effective in inhibiting adenoviral replication than silencing of the E1A early gene. A combination strategy involving downregulation of any two or all three of the targeted viral genes did not result in an enhanced inhibition of adenoviral replication compared to the single siRNA approaches targeting the late genes. However protection against adenovirus mediated cytotoxicity could only be achieved by combining siRNAs against either of the two late genes with the siRNA against the E1A early gene. Thus, an enhanced anti-adenoviral efficiency of RNAi-based inhibition strategies can be achieved by co-silencing of early and late adenoviral genes with down regulation of E1A as a crucial factor.