Einfluss verschiedener Heparinisierungskonzepte auf die Funktion und Stabilität des isoliert hämoperfundierten Schweinejejunums im Rahmen der Modelletablierung

Abstract

Die isolierte Organperfusion als Ergänzungsmethode zu Tierversuchen schafft eine sehr gu-te Voraussetzung für die genauere Untersuchung auf den Gebieten der Pharmakologie und der Toxikologie sowie der Intensiv- und der Transplantationsmedizin. Eines dieser Felder ist die Sepsis verstärkt oder verursacht durch Darmischämie mit bakterieller Translokation. Um pathophysiologische Mechanismen und therapeutische Strategien entwickeln zu können, ist es von großer Bedeutung, einzelne Mechanismen losgelöst von systemischen Nebenwir-kungen in den Fokus zu nehmen. Deshalb wurde in der vorliegenden Arbeit ein hämoperfun-diertes in vitro System für Darmfunktionsstudien etabliert. Ein wichtiger Aspekt bei der Verwendung extrakorporaler Kreisläufe ist die Aktivierung der Gerinnung des Blutes. Dementsprechend untersuchten wir den Einfluss verschiedener He- parinisierungskonzepte auf die Funktion und Stabilität des Systems. Hierbei galt es, die Ba-lance zwischen Aufrechterhaltung der Organfunktion und Gerinnungssensitivität einerseits und der Aufrechterhaltung der Funktion des zum Gasaustausch verwendeten Kapillar-Dialyse-Moduls andererseits unter in vitro Bedingungen zu etablieren. In vier Gruppen wurde über drei Stunden eine isolierte normotherme Hämoperfusion an ins-gesamt 18 Jejunumsegmenten von Schweinen durchgeführt. Als Spendertiere dienten Tiere der Kreuzung DL*PI (42 ± 5 kg; MW ± SD), denen ein Jejunumsegment mit einem durch-schnittlichen Gewicht von 191 ± 40 g (MW ± SD) entnommen wurde. Im Zusammenhang mit weiteren Organentnahmen wurden die narkotisierten Tiere durch Entbluten getötet (amtliche Anzeigennummer: O 0094/99). Je nach Versuchsgruppe (n= 4 - 5) erfolgte die Antikoagulation mit unfraktioniertem Heparin in 2 vs. 3 Stufen: 1. Tier, 2. Blutreservoir, 3. mit (m) oder ohne (o) Priming des Perfusi- onskreislaufes. Bei den Heparinkonzentrationen im Blutreservoir wurde unterschieden zwi-schen hoher (hHep) vs. niedriger (nHep) Konzentration. Die Gesamtheparinkonzentration (I.E.) inklusive Tier betrug in Gruppe 1: 15.750 ± 500 (hHep oP), Gruppe 2: 6.375 ± 679 (nHep oP), Gruppe 3: 10.904 ± 413 (nHep mP) und Gruppe 4: 11.300 ± 200 (nHep mP mCd). Zur Beurteilung der Funktion und Stabilität des Systems wurden neben hämodynamischen, hämatologischen und klinisch-chemischen Parametern auch Funktions- und Gerinnungspa-rameter erhoben. Des weiteren wurden vor und nach der jeweiligen Perfusion Proben für histologische Untersuchungen entnommen. Bei der statistischen Analyse wurden nichtparametrische Tests verwendet: zwischen zwei unabhängigen Stichproben der Mann-Whitney-U Test und zwischen zwei verbundenen Stichproben der Wilcoxon Test. In Gruppe 1 (hHep oP) traten Blutungen auf. In den niedrig heparinisierten Gruppen traten nur vereinzelt leichte Blutungen in der Mukosa auf. Ziel war es, über den arteriellen Fluss einen konstanten arteriellen Mitteldruck zu erreichen. Die am niedrigsten heparinisierte Gruppe 2 (nHep oP) wies diesbezüglich dennoch deutliche Schwankungen auf. Im Vergleich mit den Gruppen 1 (hHep oP), 3 (nHep mP) und 4 (nHep mP mCd) traten in der Gruppe 2 bis zu 75 % höhere Perfusionswiderstände (*p<0,05) auf. Ein signifikant höherer Sauerstoff-verbrauch wurde über den gesamten Perfusionszeitraum in der Gruppe 3 (nHep mP) mit Medianwerten zwischen 113,2 und 156,6 μmol/min*100 g und während der ersten zwei Per-fusionsstunden in der Gruppe 4 (nHep mP mCd) mit Medianwerten von 94,3 und 114,2 μmol/min*100 g gegenüber der Gruppe 2 (Medianwerte zwischen 50,6 und 71,8 μmol/min*100 g) festgestellt. Auch zeigten diese Gruppe eine gute Glukoseresorption, eine geringe Laktatproduktion sowie stabile Darmmotilität. Im Hinblick auf die Gerinnung zeigte die Gruppe 2 (nHep oP) eine Aktivierung der Throm-boplastinzeit, einen konstanten Abfall der Fibrinogen- und Antithrombin-III-Konzentration sowie einen konstanten Anstieg der D-Dimere. Diese Gruppe zeigte weiterhin einen signifi-kanten Abfall der Leukozytenkonzentration und einen leichten Abfall der Thrombozytenkon- zentration. In der Gruppe 3 (nHep mP) ergaben sich dagegen weitgehend konstante Verläufe der Ge-rinnungsparameter sowie insgesamt relativ konstante Werte der Leukozyten- und Thrombo-zytenkonzentration. Mit dem Heparinregime der Gruppe 3 konnten die besten Funktionspa-rameter bei gleichzeitig stabilen Perfusionsbedingungen erreicht werden und es erwies sich somit als einflussreich auf die in vitro Darmvitalität. Auch ergab die Untersuchung mit dem-selben Heparinisierungskonzept, dass der Ingesta zugeführtes Cadmium im venösen Blut um 35,4 μg/l (Differenz der Mediane) anstieg. Das Modell des isoliert hämoperfundierten Jejunums eröffnet somit einerseits die Möglichkeit Schadstoffuntersuchungen durchzuführen und andererseits Antworten auf wichtige Fragen in der Intensiv- und der Transplantationsmedizin zu finden.

Isolated organ perfusion offers, as a supplementary method to animal experiments, a very good prerequisite for a better study of the important fields of pharmacology and toxicology and of intensive care and transplantation medicine. Breakdown of the barrier function, following bacterial translocation, is an important motor for the development of sepsis. In vivo complexity often hampers the identification of a particular pathophysiological mechanism triggered by the organ itself. Thus, we established a hemop-erfused in vitro system giving access to investigations on intestinal function. Since activation of coagulation of the blood is an important aspect in research on extracorpo-real circuits we investigated different heparinisation concepts, with respect to both function and stability of the system. In four groups isolated normothermic hemoperfusion of 18 porcine jejunal segments was performed over three hours. Organs were taken from pigs of mixed DL*PI (42 ± 5kg; MEAN ± SD). Jejunal segments with an average weight of 191 ± 40 g (MEAN ± SD) were taken out under general anaesthesia. Isolating different organs the animals were sacrified by final ex-sanguinations during the blood harvesting procedure (Project: O 0049/99). Therefore, the maintenance of organ function and sensitivity of coagulation on the one hand and the func-tion of the capillary dialyse module used for gas exchange on the other hand should be es-tablished under in vitro conditions. Statistical analysis was performed using non-parametrical tests: for inter- group analyses Mann-Whitney-U test and for intra-group analyses the Wilcoxon test. Depending on the group anticoagulation with unfractionated heparin was performed in 2 vs. 3 steps: 1. animal, 2. blood reservoir, 3. with (w) or without (w/o) priming (P) of the perfusion circuit. Heparin doses in the blood reservoir were differentiated between high (Hi) vs. low (Lo) concentrations. Total heparin doses, including the animal, given in I.E.: group 1: 15.750 ± 500 (HiHep w/oP), group 2: 6.375 ± 679 (LoHep w/oP), group 3: 10.904 ± 413 (LoHep wP) and group 4 11.300 ± 200 (LoHep wP wCd). For studying the functionality and stability of the system hemodynamic, haematologic and chemical parameters as well as functional and anticoagulation parameters have been evaluated. Furthermore, histological samples were taken before and after perfusion. Group 1 (HiHep w/oP) showed massive bleeding on the mucosa, whereas the jejunal seg-ments of the low heparinised groups (LoHep) showed only partial light bleeding. Aim of the study was to achieve a constant mean arterial pressure over the arterial flow. Hereby, group 2 (LoHep w/oP) showed high fluctuations. This group (LoHep w/oP) had up to 75 % higher perfusion resistance (*p<0.05) compared to groups 1 (HiHep w/oP), 3 (LoHep wP) and 4 (LoHep wP wCd). A significantly higher oxygen consumption was found in group 3 (median between 113.2 and 156.6 μmol/min*100 g) and respectively, during the first two hours, in group 4 (median of 94.3 and 114.2 μmol/min*100 g) compared to group 2 (median beetween 50.6 and 71.8 μmol/min*100 g). These groups also showed significant glucose absorption, low lactic acid production as well as stable gut motility. Group 2 (LoHep w/oP) was characterised by a tendency for activated thromboplastin time and constant decrease in fibrinogen and antithrombin-III-concentrations and a constant in-crease of the d-dimere. This group also showed a significant decrease in leukocytes and a slight decrease in thrombocytes. Group 3 (LoHep wP), in contrast, showed almost stable values of the coagulation pattern and of the concentration of leukocytes and thrombocytes. Thereby, group 3 (LoHep wP) provided stable perfusion conditions, and a still maintained best functional capacity. The heparinisation concept of this group showed specifically fundamental influences on in vitro viability of the small intestine. Adding cadmium to the ingesta the concentration raised up to 35.4 μg/l (difference of the median) in the blood. The model of isolated hemoperfused jejunum is giving a most promising option to study the absorption of toxic substances on the one hand and to answer questions of intensive care and transplantation medicine on the other hand.