Charakterisierung von Promotor-Enhancer-Spezifität mittels CRISPR/Cas9-basiertem Austausch cis-regulatorischer Elemente

Abstract

Die raumzeitlich koordinierte Regulation der Genexpression ist essenziell für die Funktionsweise und Entwicklung von Organismen. Ein zentraler genregulatorischer Mechanismus ist die spezifische Interaktion von Promotoren mit anderen cis-regulatorischen Elementen (CRE) wie Enhancern. Trotz zahlreicher Studien sind die zugrunde liegenden Prinzipien nicht vollständig verstanden. In dieser Arbeit wird die Spezifität der Promotor-Enhancer-Interaktion unter Verwendung des Sonic-Hedgehog-(Shh)-Locus näher charakterisiert. Dabei soll analysiert werden, ob die Aktivierung von Genen auf räumlicher Nähe basiert und Enhancer, wie angenommen, modular austauschbar sind. Shh ist ein zentrales Morphogen während der Embryogenese. In der Extremitätenentwicklung ist die Shh-Expression auf den posterioren Teil der Extremitätenknospe beschränkt und wird dort allein durch den nicht redundanten Enhancer ZRS reguliert. Interessanterweise liegen Shh-Promotor und ZRS zelltypunabhängig durch eine vorgeformte Chromatinschleife in räumlicher Nähe zueinander. Mittels eines CRISPR/Cas9-basierten Austausches der ZRS mit einem in Stammzellen aktiven Sox2-Enhancer und des Shh-Gens mit einem GFP-Reporter sollte in murinen Stammzellen eine ektope Aktivierung erzielt werden. In den generierten Stammzelllinien wurde jedoch keine GFP-Expression nachgewiesen. Epigenetische Analysen der geneditierten Zellen zeigten, dass der Shh-Promotor sowie der integrierte Sox2-Enhancer reprimiert und demnach inaktiv sind. Die räumliche Nähe des Sox2-Enhancers mit dem Shh-Promotor ist folglich nicht ausreichend für eine ektope Aktivierung in Stammzellen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die upstream der ZRS liegende, hochkonservierte Sequenz – ZRS300 – mit potenziell cis-regulatorischer Funktion analysiert. Vorige Experimente zeigten einen letalen Verlauf beim Austausch der murinen ZRS300 mit der anderer Spezies. Eine Deletion der Sequenz in der Maus hatte jedoch keinen phänotypischen Effekt. Im Vergleich zu der Sequenz anderer Spezies ist die murine ZRS300 partiell deletiert. In-vivo-Reportergenassays der ZRS300 verschiedener Spezies in murinen Embryonen zeigten keine ZRS-ähnliche Aktivität, jedoch Aktivität im zentralen Nervensystem und in endodermalem Gewebe übereinstimmend mit der Shh-Expression. Eine potenziell ZRS300-induzierte Shh-Misexpression in diesen Geweben könnte den beobachteten letalen Phänotypen erklären. Diese Arbeit zeigt, dass die aktivierende Wirkung von CREs nicht allein durch räumliche Nähe auf andere Loci im selben Zelltyp übertragbar ist. Darüber hinaus wurde die ZRS300 als neuer Shh-Enhancer mit zur ZRS differierendem Aktivitätsmuster charakterisiert. Zusammenfassend gibt diese Arbeit weitere Einblicke zur spezifischen Promotor-Enhancer-Interaktion, dessen Störung zur Entstehung verschiedenster Erkrankungen beiträgt. Die Charakterisierung der zugrunde liegenden Prinzipien ist wesentlich und kann folglich Erkenntnisse für zukünftige gentherapeutische Ansätze liefern.

Spatiotemporally coordinated gene expression is crucial for functioning and development of organisms. An important mechanism of gene regulation is the specific interaction of promoters with other cis-regulatory elements (CRE), such as enhancers. Despite numerous studies, the underlying principles are not fully understood. The purpose of this work is to characterize the specificity of promoter-enhancer interactions utilizing the Sonic Hedgehog (Shh) locus as a model system and to analyze whether gene activation is based on spatial proximity and whether enhancers are modularly interchangeable, as assumed. Shh is a central morphogen during embryogenesis. In limb development, Shh expression is restricted to the posterior part of the limb bud, where it is regulated exclusively by the not redundant enhancer ZRS. Interestingly, Shh promoter and ZRS lay cell type-independently in spatial proximity due to a preformed chromatin loop. CRISPR/Cas9-based exchange of the ZRS with a Sox2 enhancer which is active in stem cells and simultaneous exchange of the Shh gene with a GFP reporter should lead into ectopic gene activation in murine stem cells. However, no GFP expression was detected in the generated stem cell lines. Epigenetic analyses of the gene-edited cells showed that the Shh promoter and the integrated Sox2 enhancer are repressed and therefore inactive. Spatial proximity of the Sox2 enhancer and the Shh promoter is not sufficient for ectopic gene activation in stem cells. In the second part of this work, ZRS300, a highly conserved sequence located upstream of ZRS, with potential cis-regulatory function was analyzed. Previous experiments showed that replacement oft the murine ZRS300 with that of other species is lethal, yet, deletion of the sequence in the mouse has no phenotypic effects. Compared to the sequence of other species the murine ZRS300 is partially deleted. In vivo reporter gene assays of ZRS300 from different species in murine embryos showed no ZRS-like activity, but activity in the central nervous system and endodermal tissue consistent with Shh expression. Potential ZRS300-induced Shh misexpression in these tissues could explain the lethal phenotype observed previously. This work demonstrates that the activating effect of CREs is not transferable to other loci in the same cell type by spatial proximity alone. Furthermore, ZRS300 was characterized as a novel Shh enhancer with an activity pattern that differs from that of ZRS. In summary, this work provides further insights into the specific promoter-enhancer interaction. The disruption of promoter-enhancer interaction contributes to the development of a wide range of disease. The characterization of the underlying principles is essential and may consequently provide insights for future gene therapy approaches.