Isolierung, Expansion, Klonierung von T-Lymphozyten aus Psoriasisplaques sowie Evaluation der T-Zell-Rezeptor-Spezifität – Definition mittels kombinatorischer Peptidbibliotheken

Abstract

Die Bedeutung von T-Zellen bei der Pathogenese der Psoriasis ist allgemein anerkannt. Trotz der Erkenntnis, dass die T-Zell-Aktivierung eine Schlüsselrolle in der Krankheitspathogenese spielt, ist nicht bekannt, wodurch diese Aktivierung ausgelöst wird. Um Näheres über den unbekannten T-Zell- Stimulus zu erfahren, bietet es sich an, die T-Zell-Rezeptor-Spezifität der Lymphozyten in entzündlichen Infiltraten zu analysieren. Die Determinierung der TZR-Spezifität von T-Zell-Klonen durch den Einsatz kombinatorischer Peptid-Bibliotheken wäre hierfür ein möglicher experimenteller Zugang. Die Valididät dieser Herangehensweise setzt allerdings die Möglichkeit voraus, pathogenetisch relevante T-Zellen in vitro zu expandieren. Die vorliegende Arbeit soll für diesen Versuch die methodische Grundlage liefern. Es konnte dokumentiert werden, dass prolongierte in vitro-Kultivierung die phänotypische Verteilung von T-Zell-Linien aus psoriatischer Haut verändert. Funktionell wurde eine starke Korrelation zwischen der Krankheitsaktivität und der Frequenz von CD3+CD8+CD25+ Zellen in läsionaler Haut festgestellt, was auf eine prominente Rolle der CD8+CD25+ T-Zell-Populationen bei der Krankheitspathogenese hinweist. Es wurde eine Methode zur Sortierung CD25+ T-Zellen aus betroffener Haut nach siebentägiger Kurzzeit-Kultur entwickelt sowie ein Protokoll zur Klonierung der isolierten T-Zellen mittels „limitierender Verdünnung“ etabliert. Weiterhin wurde gezeigt, dass eine gezielte Blockierung der Apoptose die Expansion der generierten T-Zell Klone verbessern kann. Schließlich wurde im Rahmen dieser Arbeit erstmalig die Analyse polyklonaler T-Zell-Linien anstelle von T-Zell-Klonen mittels kombinatorischer Peptidbibliotheken im sog. „positional scanning“ Format evaluiert. Als Meßvariable für die T-Zell-Stimulation mit den Peptidbibliotheken wurde erstmals die intrazelluläre FACS-basierte Messung des BrdU-Einbaus angewendet. Es wurde festgestellt, daß sich in der Tat positions- und aminosäurespezifische Effekte der Peptidbibliotheken auf primäre polyklonale T-Zell-Populationen nachweisen lassen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit stellen die methodische Grundlage zur genaueren Analyse von T-Zell-Spezifitäten bei der Psoriasis aber auch bei anderen Dermatosen mit T-Zell-Beteiligung dar.

The role of T cells in the pathogenesis of psoriasis is widely acknowledged. However, key aspects of their precise function in the disease as well as the relative pathogenetic contribution of T cell subsets are still unknown. T-cell clones have been isolated from psoriatic plaques but a study of conditions affecting the isolation and expansion of T-cell clones has not been reported to date. The determination of T-cell receptor specificities of plaque-derived T-cell clones using suitable techniques, such as combinatorial peptide libraries would be one approach towards defining the nature of relevant antigen(s). Here, we observe a correlation of disease activity with the frequency of the CD3+CD8+CD25+ subset. We show that prolonged in vitro culture changes the phenotypic subset distribution of T-cell lines derived from psoriatic skin and that T cell clones can be isolated by sorting of CD25+ cells emigrated from skin fragments after 7 days. We evaluate various conditions affecting expansion of psoriatic T cell clones in vitro and show that blocking apoptosis can facilitate proliferation of activated T-cell clones in vitro. Our results indicate a prominent role of the CD8+CD25+ subset in disease pathogenesis and should be useful in the design of experiments aiming at a systematic analysis of the specificity of clones present in psoriatic plaques.