Identifizierung transportrelevanter Aminosäurereste im proximalen C-Terminus des humanen Vasopressin V2-Rezeptors

Abstract

Der G-Protein-gekoppelte Vasopressin V2 Rezeptor vermittelt die regulierte Wasserrückresorption im Sammelrohr der Niere. Der proximale C-Terminus des Rezeptors ist für den Transport zur Plasmamembran essentiell. Verkürzungen innerhalb des proximalen C-Terminus führen zu einem im ER retinierten Rezeptor. Ein Glutamat-Dileuzin-Motiv innerhalb dieses Bereiches ist beim V2-Rezeptor zwar essentiell für den ER-Export, stellt aber kein Transport- Signal dar. In dieser Arbeit wurden die anderen Reste dieses transportrelevanten Bereichs auf ihre Bedeutung für den Oberflächentransport des V2-Rezeptors hin untersucht. Es wurden mehrere Mutationen eingeführt, und deren Auswirkungen auf den Transport in COS.1-Zellen und HEK293-Zellen hin untersucht. Alle untersuchten hydrophoben Aminosäuren dieses Bereiches: F328, V332, L336, waren ebenso wie die früher beschriebenen hydrophoben Reste L339 und L340 transportrelevant. Die Mutation dieser Reste führte zu Rezeptoren, die im ER retiniert werden. Die Mutation der im proximalen C-Terminus gehäuft auftretenden Serine S330, S331, S333, S334 und S338 hatte dagegen keinen Effekt auf den Transport. Nur die Mutation von S329, der ersten Aminosäure nach Austritt aus der Membran, führte zu Rezeptoren, die im ER retiniert werden. Die transportrelevanten Aminosäuren können zu einem linearen Transportmotiv oder einer faltungsrelevanten Struktur beitragen, deren Mutation dann zur Erkennung durch das Qualitätskontrollsystem des ER führt. Um diese Frage zu beantworten, wurde die Transportfunktion der einzelnen Aminosäuren mit Hilfe eines verkürzten Rezeptorfragments untersucht. Dieses ermöglicht Tramsportstudien unabhängig von der komplexen Faltung eines 7TMD- Proteins. Alle im Gesamtrezeptor relevanten Aminosäuren waren bei Einzel- oder Mehrfachaustausch in dem verkürzten Rezeptorfragment nicht transportrelevant. Diese Ergebnisse zeigen, dass im proximalen C-Terminus, kein unabhängiges Transportsignal vorliegt, sondern dass dieser Bereich für eine transportkompetente Faltung des Gesamtproteins wichtig ist. Basierend auf den Kristallstrukturdaten des Rhodopsins, wurde ein computergestütztes Modell des V2-Rezeptors berechnet. Der proximale C-Terminus des Rhodopsins bildet eine amphipatische α-Helix, die Helix 8. Nach dem Modell könnte der entsprechende Bereich des V2-Rezeptors ebenfalls eine α-helikale Struktur einnehmen: Die hydrophoben Aminosäuren der amphipatischen Helix 8 würden intramolekulare Wechselwirkungen mit Aminosäuren der ersten intrazellulären Schleife und der ersten transmembranären Domäne eingehen. Die postulierten Interaktionen für L339 und E335 wurden experimentell überprüft. Die erhaltenen Daten unterstützten die postulierte α-Helix nicht. Möglicherweise nimmt der proximale C-Terminus das V2-Rezeptors im ER eine Schleifen-Struktur ein. Die Daten dieser Arbeit lassen es nach der Veröffentlichung der ersten Kristallstruktur eines GPCR sinnvoll erscheinen, erneut ein Schleifen-Modell des proximalen C-Terminus zu berechnen, und anhand dieses Modells die intramolekularen Interaktionen des proximalen C-Terminus neu zu überprüfen.

The G protein-coupled human vasopressin V2 receptor mediates the regulated reabsorption of water in the renal collecting duct epithelial cells. It was shown that a glutamate/dileucine motif in the proximal C terminus is critical for receptor transport from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi apparatus. The aim of this work was to test whether the amino acids lying in the vicinity of the glutamate/dileucin motif also influence ER exit of and whether this region represents a transport signal or a folding-relevant domain. To this end, the amino acid residues in the proximal C terminus were exchanged by site-directed mutagenesis and intracellular transport of the mutant proteins in transiently transfected HEK 293 cells was assessed by glycosylation state analyses, ligand binding studies and confocal laser scanning microscopy. Mutation of the hydrophobic residues in this region (F328, V332, L336) led to receptors that are more or less trapped in the ER. These amino acids are thus necessary for ER to Golgi transport. In contrast, the multiple serin residues (S330, S331, S333, S334 and S338) of the proximal C terminus have no influence on the receptor transport, with the exception of S329 which is located most likely at the interface between the proximal C terminus and the membrane. The transport relevant amino acids in the proximal C terminus may represent a linear transport signal recognized by components of ER to Golgi vesicles. Alternatively, they may be necessary for transport- competent receptor folding to pass the quality control system of the ER. To assess these two possibilities, the transport functions of the relevant residues were studied independent of full length receptor folding. To this end the C terminus was fused to a receptor fragment consisting only of the N terminus, the first transmembrane domain and the first intracellular loop of the V2 receptor. In this system, mutation of the hydrophobic amino acid residues did not influence receptor trafficking. These results demonstrate that the hydrophobic residues are not part of a linear transport signal. Instead they are necessary to establish a transport-competent folding state. Based on the crystal structure of rhodopsin, we calculated a structure model of the V2 receptor. The model predicts that the proximal C terminus (as in rhodopsin) constitutes an amphipatic α-helix and that the hydrophobic residues of this helix interact with hydrophobic residues of the first intracellular loop and the first transmembrane domain. However, site-directed mutagenesis and transport studies to prove these interactions were not successful. Recent nuclear magnetic resonance studies for the proximal C terminus of rhodopsin indicate that this region may form both a helical and a loop structure depending on the activation state of the protein. If the same holds true for the V2 receptor, future experiments to prove interactions within the receptor molecule should be repeated based on a newly-calculated loop model.