Identification and characterization of genes essential for oncolytic Newcastle disease virus replication in human tumor cells

Abstract

Newcastle disease virus (NDV) is an avian paramyxovirus with a negative- stranded RNA genome. It has a natural preference for replicating in tumor cells but not in normal cells. Therefore, NDV is currently under investigations for oncolytic virotherapy. A defective antiviral response in tumor cells is assumed to be responsible for tumor-selective viral replication. However, the precise link between tumorigenesis and sensitivity to oncolytic viruses is not fully understood and needs to be analyzed in more detail in order to improve therapeutic efficacy. To address this issue, a human cell line model has been set up based on a non-tumorigenic keratinocyte cell line HaCaT and a derived Harvey-Rat sarcoma (H-Ras)-transformed and in vivo tumor-passaged clone RT3. In contrast to HaCaT cells, the tumorigenic cell line RT3 was partially susceptible to NDV. A RT3-derived subclone K1 featured an increased tumor growth potential in nude mice and a higher NDV susceptibility compared to the parental cell line RT3. This model for oncolysis was utilized to systematically analyze pathways which are supposed to promote NDV susceptibility. Investigations of the Interferon (IFN)-signaling pathway as a reason for NDV susceptibility of RT3 and RT3 K1 cells did not show severe tumor cell-specific defects. Nevertheless, retarded induction and expression levels of several IFN-inducible antiviral factors following NDV infection could be observed. However, the most affected antiviral factor “Interferon inducible transmembrane protein I” was demonstrated to be dispensable for counteracting NDV replication. It indicated that oncolytic NDV replication could not exclusively depend on impaired IFN- mediated antiviral activity. Oncogenic H-Ras, which had been used for tumorigenic transformation, was found to be necessary for virus replication in RT3 K1 cells but was not sufficient to render HaCaT cells NDV-susceptible. A focused siRNA screening approach on the basis of oncolytic NDV replication in RT3 K1 cells revealed additional oncolytic NDV-sensitizing cellular factors. Several genes with NDV-sensitizing properties but no direct connection with the IFN- signaling pathway were confirmed. Some of them were also found to be tumor cell-specifically overexpressed. The NDV-sensitizing Rho GTPase “Ras- related C3 botulinum toxin substrate 1” (Rac1) was demonstrated to be essential for NDV replication not only in H-Ras transformed RT3 K1 cells but also in epithelial cancer cells with Kirsten-Ras mutation. Unlike Ras, Rac1 was sufficient to render non-tumorigenic HaCaT cells susceptible to NDV replication. Initial experiments hint to a role for Rac1 in viral uptake and anchorage- independent growth in RT3 K1 cells. Rac1 activity has been reported to be tightly connected with oncogenic Ras activity. Therefore, increased viral uptake, due to Rac1-mediated elevated endocytotic activity, could provide a link between Ras-induced tumorigenesis and oncolytic virus sensitivity in addition to defects in IFN-mediated antiviral defense. In summary, this unique epithelial cell line model for NDV oncolysis in combination with the RNA interference screening approach identified novel NDV- sensitizing factors involved in cellular pathways such as clathrin-mediated processes and actin cytoskeleton reorganization. These results provide a basis for the identification of tumor-associated biomarkers for oncolytic virus replication and novel targets for anti-cancer therapy.

Das Newcastle disease virus (NDV) ist ein aviäres Paramyxovirus mit einem RNA- Genom in Negativstrangorientierung. Das Virus zeichnet sich durch eine selektive Replikation in Tumorzellen aus, so dass es gegenwärtig in der onkolytischen Virotherapie klinisch getestet wird. Es wird vermutet, dass die tumorselektive Replikation auf Defekte in der antiviralen Abwehr beruht. Der genaue Zusammenhang zwischen Tumorigenese und Suszeptibilität für onkolytische Viren ist bisher aber nicht vollständig geklärt. Ein besseres Verständnis dieses Zusammenhangs kann dazu beitragen, die antitumorale Effizienz dieser Viren zu verbessern. Für diese Untersuchungen wurde ein humanes Zelllinienmodel herangezogen. Es basierte auf der nicht-tumorigenen Keratinozytenzelllinie HaCaT und der durch Harvey Rat sarcoma (H-Ras)-transformierten und mehrfach in vivo tumorpassagierten HaCaT Zelllinie RT3. Im Gegensatz zu HaCaT Zellen, erwiesen sich RT3 Zellen als partiell NDV- suszeptibel. Der isolierte Subklon K1 zeichnete sich nicht nur durch ein erhöhtes Tumorwachstum in Nacktmäusen aus, sondern auch durch eine verstärkte NDV-Suszeptibilität im Vergleich zu den parentalen RT3 Zellen. Untersuchungen an diesem Modellsystem für Onkolyse zeigten, dass keine massiven tumorzell- spezifischen Defekte im Interferon (IFN)-Signalweg vorliegen. Allerdings waren die Induktions- und Expressionslevel einiger IFN-stimulierter, antiviraler Proteine tumorzell-spezifisch vermindert. Der am stärksten gehemmte antivirale Faktor „Interferon-stimuliertes Transmembranprotein 1“ zeigte jedoch keine NDV-spezifische antivirale Wirkung. Im Gegensatz dazu konnte nachgewiesen werden, dass onkogenes H-Ras als NDV-sensitivierende Komponente in den Ras- transformierten RT3 K1 Zellen fungiert. Es bewirkte aber in HaCaT Zellen keine generelle NDV-Suszeptibilität. Ein fokussiertes siRNA-Screening basierend auf der NDV-Replikation in RT3 K1 Zellen enthüllte zusätzliche NDV-sensitivierende Proteine. Diese zeigten keine direkte Verbindung zum IFN-Signalweg und waren teilweise auch tumorzell-spezifisch überexprimiert. Die Rho GTPase “RAS- verwandtes C3-Botulinum-Toxin-Substrat 1” (Rac1) stellte sich als notwendige Komponente für die NDV-Replikation in den H-Ras transformierten RT3 K1 Zellen heraus. Auch für andere epitheliale Tumorzelllinien mit Kirsten-Ras Mutationen konnte ein Zusammenhang zwischen Rac1-Aktivität und NDV-Suszeptibilität nachgewiesen werden. Im Gegensatz zu H-Ras führte eine Überexpression von Rac1 zur NDV-Suszeptibilität von HaCaT Zellen. Die Rac1-Aktivität wird durch die onkogene Aktivität von Ras beeinflusst. Tatsächlich verhinderte die dominant negative Rac1-Mutante das kontaktunabhängige Wachstum von RT3 K1 Zellen. Rac1 könnte demnach eine Verbindung zwischen Ras-induzierter Tumorigenese und NDV- Suszeptibilität darstellen. Möglicherweise führt eine verstärkte Rac1-Aktivität zu einer gesteigerten endozytotischen Aktivität und somit zu einer erhöhten Internalisierung von NDV in Tumorzellen. Zusätzlich könnten Defekte in der antiviralen Abwehr die NDV-Replikation in diesen Zellen begünstigen. Mit Hilfe des epithelialen Zelllinienmodels für NDV Onkolyse kombiniert mit einem siRNA Screening konnten neue NDV-sensitivierende Proteine identifiziert werden. Diese Faktoren sind an verschiedenen zelluläre Signalwegen wie z.B. an Clathrin-vermittelten Prozessen und der Reorganisation des Aktinzytoskeletts beteiligt. Diese Ergebnisse sollten ein guter Ausgangspunkt sein, um tumorassoziierte Biomarker für die Virotherapie und neue therapeutische Zielmoleküle für die Behandlung von Krebs zu finden.