Systems view of neuronal mRNA localisation - comparative analysis and determinants of the sub-cellular neuronal transcriptome

Abstract

Control over the intracellular localisation of RNA is an important aspect of post-transcriptional regulation, especially for highly polarised cells like neurons. The presence of specific transcripts in axons and dendrites, together neurites, is determined by cis-active elements called zipcodes and ultimately allows neurons to locally synthesise required proteins and adapt quickly to cues of the local environment. This capability is important for the correct function of synapse remodelling and memory formation and a disruption of RNA localisation in neurons has been associated with several neurodegenerative diseases.

Using RNA sequencing a vast number of transcripts can be detected in neurites of neuronal model systems. With over 7500 transcripts even the neurite core transcriptome, which I summarised from the published datasets generated in the last decade, contains at least half or a third of the full neuronal transcriptome. Whether all of these transcripts should be considered localised to neurites or if this designation is better determined by differential expression analysis between compartments is still diffcult to answer. For one thing, no strong overlap of transcripts with localisation based on significant enrichment in many individual datasets exists and also my integrated analysis utilising batch correction did only generate a relatively small set of differentially expressed genes, which however tend to have more conserved enrichment. Secondly, several transcripts that are generally considered as classical localised transcripts, like the Actb mRNA, are not relatively enriched in neurites, even if they are strongly expressed there.

Relying on a set of transcripts with consistent neurite enrichment based on datasets from primary murine neurons I designed Nzip, a massively parallel reporter assay (MPRA) aimed at the identification of unknown zipcodes. Based on 16 candidate sequences determined from the first experiment, it was possible to identify 2 new zipcode motifs utilising a secondary library with a mutational analysis approach: the let-7 miRNA seed sequence CUACCUC and an (AU)𝑛 repeat motif. The compartmental quantification of miRNAs and associated protein machinery indicates a stronger activity of let-7 in soma, providing a potential mechanism for its zipcode activity. Additionally, also the (AU)𝑛 motif is also associated with lower read counts in soma and several identified binding proteins have known effects on RNA stability, indicating that it likely also affects RNA localisation through stability regulation. Building on my observations that assignment of RNA localisation state based on either detection or enrichment in neurites both is problematic and that Nzip mainly identified motifs conferring neurite enrichment by RNA stability, I argue that a clear distinction between localised and not-localised tran- scripts may not be an accurate description of the biological system. Instead, zipcodes likely affect the probability of a given transcript to reach neurites and there may also be different mechanisms that affect the tendency for localisation as measured by enrichment or detection. Whether this is a more accurate description of RNA localisation mechanics as well as the exact functions of the zipcodes I identified should be further investigated in future studies.

As a second part of my work I have contributed to studying the human neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS). This affliction is mainly characterised by the degradation of motor neurons usually starting at the synapses between axons and skeletal muscle, the neuromuscular junction (NMJ), and in many cases is known to be caused by mutations in several RNA binding proteins affecting RNA localisation. Among these is the FUS protein, whose mutations often disrupt its exclusive nuclear localisation and thus can lead both to a loss-of-function as well as a toxic gain-of-function trough availability of new RNA targets in the cytoplasm. To study a disease like ALS a cellular model system for human neurons is needed, which replicates the relevant molecular signatures of affected motor neurons, specifically including the axonal containing neurite compartment. I have characterised the transcriptome and proteome of induced motor neurons (iMN) generated by expression of NGN2, ISL1 and LHX3 transcription factors. This system showed expected expression of marker genes throughout motor neuron differentiation as well as proper specification of neurite compartment and similarity with signatures of electrophysiological maturity. Using the iMN model system I performed investigative analysis for the effect of ALS patient derived FUS mutations on the proteome and transcriptome, specifically including effects pronounced in the neurite compartment. With this I identified many differentially expressed genes already associated with ALS or FUS mutations, which, however, span a very wide field of functional associations and to my understanding are more likely linked to a disruption of normal FUS activity. However, I also observed a more consistent and rarely reported pattern of down-regulation of genes building the extracellular matrix around the NMJ, which was specifically notable in the neurites of cells with cytoplasmic localised P525L FUS. Additionally, I found a very similar pattern of down-regulation in neurites for genes passing the secretory pathway, known target transcripts of FUS, as well as those with a G-quadruplex motif, which has been identified as a potential binding site for both FUS and other ALS associated RBPs. This highlights a potential toxic gain-of-function for FUS as well as a particular pathway which may be important in the axonal degeneration in ALS. Validation of this observation including any potential significance of an overlap between the affected gene groups I identified should be the focus of further work.

Die Kontrolle über die intrazelluläre Lokalisation von RNA is ein wichtiger Aspekt der post-transkriptionalen Regulation, insbesondere für stark polarisierte Zellen wie Neuronen. Die Präsenz von bestimmten RNA Molekülen in Axonen oder Dendriten, zusammen Neuriten, wird durch cis-aktive Elemente, sogenannte ’Zipcodes’, bestimmt und erlaubt ultimativ, dass Neuronen schnell auf Reize reagieren und benötigte Proteine dort lokal synthetisieren können. Diese Fähigkeit ist essentiell, damit die Remodellierung von Synapsen und das Bilden von Erinnerungen korrekt funktioniert, weiterhin wurde die Störung von RNA-Lokalisation mit der Pathophysiologie mehrerer neurodegenerativer Erkrankungen in Zusammenhang gebracht. Durch RNA Sequenzierung kann eine große Anzahl von Transkripten in Neuriten von Modellsystemen für Neuronen identifiziert werden. Mit über 7500 verschiedenen Transkripten enthält selbst das Kerntranskriptom, das ich aus den veröffentlichten Datensätzen der letzten Jahre zusammengestellt habe, nahezu ein Drittel oder die Hälfte des kompletten neuronalen Transkriptoms. Ob all diese Transkripte tatsächlich als lokalisiert angesehen werden sollten oder ob diese Bezeichnung besser durch differenzielle Expression zwischen Zellfraktionen bestimmt werden sollte, ist schwer zu beurteilen. Einerseits gibt es keine klare Übereinstimmung von Transkripten mit differenzieller Lokalisation zwischen einzelnen Datensätzen und auch mit meiner integrativen Datenanalyse inklusive Batch-Korrektur konnte ich nur ein relativ kleines Set an differenziell exprimierten Transkripten identifizieren. Zum anderen gibt es einige Transkripte, die im allgemeinen als lokalisiert angesehen werden, wie beispielsweise die Actb mRNA, die allerdings trotzdem keine relative erhöhte Expression in Neuriten aufzeigen, auch wenn sie dort stark exprimiert sind.

Mit einem Set von in primären murinen Neuronen konsistent Neurit-angereicherten Transkripten habe ich ’Nzip’ konstruiert, ein massiv paralles Reporter Experiment mit dem Ziel unbekannte Zipcodes zu identifizieren. Mit 16 potentiellen Sequenzen, die in einem ersten Experiment entdeckt wurden und einem Mutations-Analyse Ansatz war es möglich 2 neue Zipcodes zu bestimmen: die let-7 miRNA Zielsequenz CUACCUC und ein (AU)𝑛 Motiv. Die Zellfraktion-spezifische Quantifizierung von miRNAs und ihrer assoziierten Proteinmaschinerie legt zusätzlich nahe, dass die Aktivität von let-7 im Zellkörper stärker ist, was einen potentiellen Mechanismus für diese Zipcode Aktivität liefert. Weiterhin wurde auch für das (AU)𝑛 Motiv eine ähnliche Reduzierung von RNA Molekülen in Zellkörper festgestellt und einige der dazu identifizierten Bindeproteine können die Stabilität von RNA beeinflussen, sodass dieses Motif RNA Lokalisation vermutlich ebenfalls über Stabilitätsregulation kontrolliert.

Aufbauend auf meinen Beobachtungen, dass die Designation des RNA Lokalisationsstatus basierend auf entweder Detektion oder Anreicherung in Neuriten problematisch ist, und dass Nzip primär Motive identifiziert hat, die RNA Anreicherung durch Stabilität kontrollieren, bin ich der Auffassung, dass eine klare Unterscheidung zwischen lokalisierten und nicht lokalisierten Transkripten nicht unbedingt einer akkuraten Beschreibung entspricht. Stattdessen halte ich es für zutreffender, dass Zipcodes die Wahrscheinlichkeit beeinflussen, dass eines gegebenes Transkript den Zellkörper verlässt, und dass potentiell unterschiedliche Mechanismen die Präsenz und Anreicherung von Transkripten in Neuriten kontrollieren. Ob dieses Modell von RNA Lokalisation korrekt ist sowie die exakte Funktionsweise der entdeckten Zipcodes, muss allerdings noch durch weitere Untersuchungen kontrolliert werden.

Der zweiten Teil meiner Arbeit widmet sich der Erforschung der neurodegenerativen Erkrankung Amyotrophe Lateralsklerose (ALS). Diese zeichnet sich vor allem dadurch aus, dass Motorneuronen beginnend an den Synapsen zwischen Axonen und Muskeln, der neuromuskulären Endplatte (NME), degenerieren. Weiterhin gibt es RNA bindende Proteine, deren Mutationen die Krankheit auslösen können. Unter diesen befindet sich das FUS Protein, dessen Mutation oft seine Lokalisation im Zellkern beeinträchtigt und damit sowohl zu funktionalem Verlust als auch zu neuen toxischen Funktionen durch das Binden anderer RNA Moleküle im Zytoplasma führen kann.

Um eine Krankheit wie ALS zu erforschen ist ein zelluläres Modellsystem für humane Neuronen erforderlich, das relevante molekulare Signaturen der betroffenen Motorneuronen und insbesondere der Axon- und Neurit-Fraktion abbildet. Ich habe das Transkriptom und Proteom von induzierten Motor- neuronen (iMN) charakterisiert, die durch die Expression von NGN2, ISL1 und LHX3 generiert werden. Dieses System zeigt die während der Motorneuron-Differenzierung erwarteten Expressionsmuster sowie klar spezifizierte Neurite und Ähnlichkeit zu elektrisch aktiven Signaturen.

Mit dem iMN System habe ich eine erste Untersuchung der Effekte von FUS Mutationen aus ALS Patienten auf das Proteom und Transkriptom und insbesondere die Neurit Fraktion durchgeführt. Dabei habe ich einige differentiell exprimierte Gene gefunden, die bereits mit ALS oder FUS Mutationen assoziert wurden, allerdings auch ein sehr breites funtionales Spektrum umfassen und daher vermutlich mit der Störung von normaler FUS Funktion zusammenhängen. Zusätzlich habe ich aber auch eine konsistente und bisher weniger beachtete Expressionsreduktion von Genen der extrazellulären Matrix nahe der NME beobachtet, die insbesondere in Neuriten von Zellen mit zytoplasmatischem P525L FUS präsent ist. Weiterhin habe ich ähnliche Muster mit reduzierter Expression von den Genen gefunden, die den Sekretionsweg passieren, bekannte Bindeziele von FUS sind, oder ein G-Quadruplex Motiv besitzen, wobei letzteres als potentielle Bindestelle für FUS und andere ALS assoziierte Proteine identifiziert wurde. Auch wenn diese Beobachtungen einen potentiellen toxischen Funktionsgewinn für FUS darstellen und einen bestimmten molekularen Pfad hervorheben, der wichtig für den Verlauf von ALS sein könnte, müssen sie noch durch weitere Studien verifiziert werden, da insbesondere die Signifikanz einer Überschneidung der von mir identifizierten betroffenen Gen-Gruppen bisher nicht klar ist .