Dissecting regional heterogeneity and modeling transcriptional cascades in brain organoids

Abstract

Over the past decade, there has been a rapid expansion in the development and utilization of brain organoid models, enabling three-dimensional in vivo-like views of fundamental neurodevelopmental features of corticogenesis in health and disease. Nonetheless, the methods used for generating cortical organoid fates exhibit widespread heterogeneity across different cell lines. Here, we show that a combination of dual SMAD and WNT inhibition (Triple-i protocol) establishes a robust cortical identity in brain organoids, while other widely used derivation protocols are inconsistent with respect to regional specification. In order to measure this heterogeneity, we employ single-cell RNA-sequencing (scRNA-Seq), enabling the sampling of the gene expression profiles of thousands of cells in an individual sample. However, in order to draw meaningful conclusions from scRNA-Seq data, technical artifacts must be identified and removed. In this thesis, we present a method to detect one such artifact, empty droplets that do not contain a cell and consist mainly of free-floating mRNA in the sample. Furthermore, from their expression profiles, cells can be ordered along a developmental trajectory which recapitulates the progression of cells as they differentiate. Based on this ordering, we model gene expression using a Bayesian inference approach in order to measure transcriptional dynamics within differentiating cells. This enables the ordering of genes along transcriptional cascades, statistical testing for differences in gene expression changes, and measuring potential regulatory gene interactions. We apply this approach to differentiating cortical neural stem cells into cortical neurons via an intermediate progenitor cell type in brain organoids to provide a detailed characterization of the endogenous molecular processes underlying neurogenesis.

Im letzten Jahrzent hat die Entwicklung und Nutzung von Organoidmodellen des Gehirns stark zugenommen. Diese Modelle erlauben dreidimensionale, in-vivo ähnliche Einblicke in fundamentale Aspekte der neurologischen Entwicklung des Hirnkortex in Gesundheit und Krankheit. Jedoch weisen die Methoden, um die Entwicklung kortikaler Organoide zu verfolgen, starke Heterogenität zwischen verschiedenen Zelllinien auf. Hier weisen wir nach, dass eine Kombination dualer SMAD und WNT Hemmung (Triple-i Protokoll) eine konstante kortikale Zuordnung in Hirnorganoiden erzeugt, während andere, weit verbreitete und genutzte Protokolle in Bezug auf kortikale Spezifizierung keine konstanten Ergebnisse liefern. Um die Heterogenität zu messen, haben wir Einzelzell-RNA Sequenzierung (scRNA-Seq) benutzt, wodurch die Erfassung der Genexpression von Tausenden von Zellen in einer Probe möglich ist. Um jedoch sinnvolle Schlüsse aus diesen scRNA-Seq Daten zu ziehen, müssen technische Artifakte identifiziert und aus den Daten entfernt werden. In dieser Dissertation stellen wir eine Methode vor, um eines solcher Artifakte zu erkennen: leere Tröpfchen (ohne Zellen), die hauptsächlich aus freischwebender mRNA in der Probe bestehen. Weiterhin können Zellen anhand ihrer Genexpressionsprofile entlang einer Entwicklungsschiene angeordnet werden, die die Entwicklung der Zellen während ihrer Differenzierung rekapituliert. Auf der Grundlage dieser Entwicklungsreihenfolge modellieren wir die Genexpression mit einem Bayes’schen Inferenzansatz, um die Dynamik der Transkription in sich differenzierenden Zellen zu messen. Dies ermöglicht das Anordnen von Genen entlang einer Transkriptionskaskade, sowie statistische Untersuchungen in Hinblick auf Unterschiede in der Veränderung von Genexpression, und das Messen des Einflusses möglicher Regulationsgene. Wir wenden diese Methode an, um kortikale neuronale Stammzellen zu untersuchen, die sich über einen intermediären Vorläuferzelltyp in kortikale Neuronen in Hirnorganoiden differenzieren, und um eine detaillierte Charakterisierung der molekularen Prozesse zu liefern, die der Neurogenese zugrunde liegen.