Molecular profiling of sex-specific podocyte stress response in response to mTOR inhibition

Abstract

Strong sexual dimorphism exists in many kidney diseases, progression to End-Stage Kidney Disease and renal graft functions. However, molecular mechanisms remain poorly understood. Podocytes are the most important cell-type of the glomerulus regulating integrity and function of the glomerular filtration barrier. Sex differences in their molecular components and functional stress responses might be crucial for these clinically relevant sex differences. Therefore, these cells were chosen as targets for the following study investigating intrinsic sexual dimorphism on genomic and proteomic levels and sex-specific differences in response to mTOR inhibition by rapamycin in an in vivo stress model in mice. Metabolomic studies of renal cortex tissues from the same experimental groups were included to investigate the functional consequences of sexual dimorphic molecular signatures. Male and female ROSAmT/mG-NHPS2(podocin)Cre mice with GFP-expression restricted to podocytes were treated with rapamycin or vehicle for three weeks. Renal functional parameters were monitored using metabolic cages prior to sacrifice. The genetic mouse model allowed isolation of highly pure podocytes by sequential perfusion of kidneys and fluorescence activated cell sorting after tissue digestion. Kidneys were perfused for subsequent podocyte isolations for sequencing and proteomics or directly snap frozen for histology and metabolomics. qRT-PCR, western blots and immunohistological stainings were performed for validation of omics studies and further molecular characterizations. Although kidney function and morphology remained normal in all experimental groups, RNA sequencing revealed strong intrinsic sex-differences with more than 1700 mRNA transcripts significantly sex-differently expressed. Furthermore, stress responses due to mTOR inhibition displayed sexual dimorphism in transcriptomes and metabolomes and signaling differences as assessed by western blots. Gene set enrichment analyses of sequencing data pointed to sex-differences in enriched GOs related to transcription, cytoskeleton and focal adhesion in male and mitochondria and translation in female podocytes. Proteomics displayed in addition to significant enrichment in mitochondrial proteins increased abundance of basal cell proteins in females. Rapamycin treatment abolished significant sex differences, yet rather due to increased changes in male podocytes whereas the female transcriptome remained more stable towards treatment-induced changes. Metabolomics further supported this finding that females appeared to be less sensitive towards mTOR inhibition by showing less accumulation of amino acid pool and glycolysis metabolites after rapamycin. In conclusion, for the first-time podocyte-specific sexual dimorphism in gene regulation and protein expression patterns were identified together with sex-different metabolic changes in stress responses, which might contribute significantly to sex differences in renal disease susceptibilities and progression.

Viele Nierenerkrankungen, die zeitliche Entwicklung hin zum terminalen Nierenversagen, sowie die Funktion von Nierentransplantaten weisen einen starken sexuellen Dimorphismus auf. Die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen sind jedoch weiterhin nur unzureichend erforscht. Podozyten sind die wichtigsten glomerulären Zellen, die die Integrität und Funktion des glomerulären Filters regulieren. Geschlechterunterschiede in ihren molekularen Komponenten und funktionellen Stressantworten könnten dafür eine entscheidende Rolle spielen. Daher wurden diese Zellen in der folgenden Arbeit ausgewählt, um intrinsische Geschlechterunterschiede auf Genom- und Proteomebene, sowie sex-spezifische Unterschiede in der Stressantwort durch mTOR-Signalweghemmung mittels Rapamyzin in einem in vivo Mausmodell zu untersuchen. Um Auswirkungen auf den Metabolismus zu adressieren, wurden die Studien durch Metabolomics von Nierenkortexgewebe der gleichen experimentellen Gruppen ergänzt. Männliche und weibliche ROSAmT/mG-NHPS2(podocin)Cre-Mäuse mit spezifischer GFP-Expression auf Podozyten wurden 3 Wochen mit Rapamyzin oder Vehikel behandelt. Metabolische Käfige ermöglichten eine genaue Bestimmung der Nierenfunktionsparameter. Aufgrund des genetischen Mausmodells konnten spezifisch reine Podozytenfraktionen nach Nierenperfusion, Verdauungsschritten und fluoreszenzaktiviertem Zellsortieren isoliert werden. Diese wurden für Sequenzierungen und Proteomics verwendet. Weitere Nieren wurden für histologische Analysen und Metabolomics direkt schockgefroren.qRT-PCR, Westernblots and immunohistologische Färbungen wurden zur Validierung der Omicsstudien und für weitere molekulare Charakterisierungen eingesetzt. Trotz normaler Nierenfunktion und Nierenmorphologie bei allen experimentellen Gruppen fanden sich bei der RNA-Sequenzierung hochsignifikante Geschlechterunterschiede bei mehr als 1700 mRNA-Transkripten. Veränderungen induziert durch die Stressantwort auf mTOR-Hemmung wiesen ebenso sexuellen Dimorphismus im Transkriptom und Metabolom auf, sowie Signalwegsunterschiede, wie mithilfe von Westernblots gezeigt werden konnte. Gengruppen-Enrichment Analysen deuteten auf Geschlechterunterschiede in angereicherten Genontologien für Transkription, Zytoskelett und Fokale Adhäsionen in männlichen und mitochondrialer Proteine und Translation in weiblichen Podozyten hin. Proteomics wies zusätzlich zu mitochondrialen Proteinen eine Anreicherung von basalen Zellproteinen bei weiblichen Podozyten auf. Rapamyzin beseitigte die signifikanten Geschlechterunterschiede, allerdings eher aufgrund erhöhter Veränderungen bei männlichen Podozyten bei insgesamt stabilerem weiblichen Transkriptom. Metabolomics bestätigte dieses sex-differente Verhalten in Bezug auf Rapamyzinbehandlung. Weibliche Podozyten erschienen stressresistenter und zeigten eine geringere Akkumulation im Aminosäurenpool und von Metaboliten der Glykolyse als männliche Podozyten. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit erstmals gezeigt werden, dass Podozyten signifikante Unterschiede in der Genregulation und Proteinexpression aufweisen zusammen mit geschlechtsspezifischen metabolischen Stressanpassungen, was entscheidend zu den Geschlechterunterschieden der Entwicklung von Nierenerkrankungen und deren Progress beitragen könnte.