Characterization of functional expression of cannabinoid receptor 1 and transient receptor potential vanilloid 1 channel in human corneal endothelial cells

Abstract

Corneal endothelial cells are crucially involved in maintaining the transparency of the human cornea. Severe losses in corneal endothelial cell density (ECD) can lead to corneal edema, gradual loss of vision, and at worst blindness. Cell degeneration processes and apoptosis are implicated with Ca2+. Thus, phenotypic characteristics of these cells are controlled by Ca2+-dependent cellular mechanisms. Transient receptor potential channels (TRPs) are substantially involved in the regulation of intracellular calcium concentration ([Ca2+]i) whereby TRP vanilloid type 1 (TRPV1) (capsaicin receptor) modulates apoptosis. Studies have shown that G protein-coupled receptors (GPCRs) such as cannabinoid receptor type 1 (CB1) are expressed in human corneal epithelial cells (HCEPs). Further studies about nerve growth factor (NGF) revealed that exogenous NGF can stimulate the proliferation of HCEP. In this study, the functional expression of TRPV1, CB1, and NGF in human corneal endothelial cells (HCECs) was investigated. [Ca2+]i was measured by fluorescence calcium imaging and whole-cell currents were measured by the planar patch-clamp technique. The human HCEC line (HCEC-12) was used as an established in vitro cell model and a TRPV1 transduced HCEC-12 (TRPV1-HCEC-12) was used as a heterologous cell expression system. Extracellular application of 10 µM capsaicin (CAP) led to an increase of the fluorescence ratio (f340/f380), which is proportional to [Ca2+]i, and an increase of whole-cell currents. Both effects were inhibited by the TRPV1 antagonist capsazepine (CPZ) (10 µM). The CB1 agonist WIN 55,212-2 (10 µM), increased [Ca2+]i and whole-cell currents, which could be blocked with the CB1 antagonist AM251 (10 µM). The CAP (10 µM) induced Ca2+ rise was inhibited below the Ca2+ baseline if the HCEC-12 cells were preincubated with 10 µM WIN 55,212-2, whereas 10 µM AM251 only slightly influenced this effect. The CAP-induced Ca2+ increase was at considerably higher levels in TRPV1 transduced-HCEC-12 than in non-transduced HCEC-12 (controls). The WIN 55,212-2-induced Ca2+ response pattern was changed if the cells were preincubated with CAP or CPZ (both 10 µM). Finally, NGF (50 ng/ml) increased [Ca2+]i, which was suppressed by CPZ. Taken together, the functional expression of CB1 and TRPV1 was first shown in normal HCEC-12 as well as in TRPV1-HCEC-12, in which the effects were at higher levels confirming the successful overexpression of TRPV1 in HCEC-12. Furthermore, there is a crosstalk between TRPV1 and CB1 as well as NGF indicating a complex Ca2+ regulation in HCEC-12. The results contribute to a better understanding of Ca2+ regulatory mechanisms and may be useful for the development of novel strategies to improve the preservation of corneal grafts for keratoplasty.

Korneale Endothelzellen sind maßgeblich an der Aufrechterhaltung der Transparenz der humanen Hornhaut involviert. Geringe Endothelzelldichte (ECD) kann zu kornealem Ödem, allmählichen Sehverlust und schlimmstenfalls zur Erblindung führen. Daran sind degenerative Prozesse und Apoptose mit Ca2+ beteiligt. Von daher sind die Eigenschaften dieser Zellen von Ca2+ abhängigen zellulären Mechanismen geprägt. In der Regulation der intrazellulären Ca2+ Konzentration ([Ca2+]i) sind „transient receptor potential“ (TRP) Kanäle substanziell beteiligt wobei der TRP Vanilloid 1 (TRPV1) bekannt als Capsaicinrezeptor Apoptose moduliert. Studien haben gezeigt, dass G-Protein gekoppelte Rezeptoren wie der Cannabinoid Rezeptor 1 (CB1) in humanen Hornhautepithelzellen (HCEPs) exprimiert werden. Studien zum Nervenwachstumsfaktor (NGF) ergaben, dass exogenes NGF die Proliferation von kornealen Endothel- und Epithelzellen von Kaninchen und Menschen stimuliert. In dieser Arbeit wurde die funktionelle Expression von TRPV1, CB1 und NGF in humanen kornealen Endothelzellen (HCEC) untersucht. [Ca2+]i wurde mit Hilfe von Fluoreszenz Calcium Imaging und Ganzzellströme wurden mittels planarer Patch-Clamp Technik gemessen. Die HCEC-12 Zelllinie wurde als etabliertes in vitro Zellmodell sowie eine TRPV1-transduzierte HCEC-12 Zelllinie als heterologes Zellsystem verwendet. Extrazelluläre Applikation von 10 µM Capsaicin (CAP) führte sowohl zu Erhöhung des Fluoreszenzratios (f340/f380), das proportional zu [Ca2+]i ist, also auch zu Erhöhung der Ganzzellströme. Beide Effekte konnten mit dem TRPV1 Kanalblocker Capsazepin (CPZ) (10 µM) unterdrückt werden. Der CB1 Agonist WIN 55,212-2 (10 µM) erhöhte [Ca2+]i und Ganzzellströme, welche mit dem CB1 Antagonisten AM251 (10 µM) geblockt werden konnten. Der CAP-induzierte Ca2+ Anstieg konnten in Zellen, die mit 10 µM WIN 55,212-2 vorinkubiert wurden, bis unter die Ca2+ Basislinie unterdrückt werden, während 10 µM AM251 diesen Effekt eher geringfügig beeinflusste. Der CAP-induzierte Ca2+ Anstieg war in TRPV1-HCEC-12 erwartungsgemäß wesentlich stärker als in nicht-transduzierten HCEC-12 (Kontrollen). Das WIN 55,212-2-induzierte Ca2+ Antwortmuster änderte sich in Zellen, die mit CAP oder CPZ behandelt wurden (10 µM). Schließlich erhöhte auch NGF (50 ng/ml) [Ca2+]i, welche ebenfalls durch CPZ unterdrückt werden konnte. Zusammenfassend konnte erstmalig die funktionale Expression von CB1 und TRPV1 in normalen HCEC-12 sowie TRPV1-transduzierten HCEC-12 gezeigt werden, wobei die Effekte in den transduzierten Zellen stärker waren und damit die erfolgreiche Transduktion von TRPV1 in HCEC-12 bestätigte. Darüber hinaus besteht ein Crosstalk zwischen TRPV1 und CB1 sowie NGF, welcher auf eine komplexe Ca2+ Regulation in HCEC-12 hindeutet. Die Ergebnisse tragen zu einem besseren Verständnis der Ca2+ Regulationsmechanismen bei und können für die Entwicklung neuartiger Strategien für die Verbesserung der Erhaltung von Hornhauttransplantaten für die Keratoplastik beitragen.