Wirkung von rekombinantem humanem aktiviertem Protein C auf humane Endothelzellen und endotheliale Progenitorzellen

Abstract

Das körpereigene „Aktivierte Protein C“ (APC) nimmt aufgrund seiner antikoagulativen und profibrinolytischen Wirkung eine Schlüsselfunktion in der Regulation der Blutgerinnung und der Aufrechterhaltung des hämostatischen Gleichgewichts ein. Darüber hinaus vermittelt APC antiinflammatorische und zytoprotektive Effekte, wodurch es auch als Entzündungs-modulator fungieren kann. Da das Krankheitsbild der Sepsis mit einer überschießenden Gerinnungsaktivierung sowie einer systemischen Entzündungsreaktion verbunden ist, gewann rekombinantes humanes APC (rhAPC) im Rahmen der Sepsistherapie an Bedeu-tung. Zahlreiche Studien an Patienten mit schwerer Sepsis belegen, dass eine Behandlung mit rhAPC die Mortalitätsrate senkt und den weiteren Verlauf der Erkrankung positiv beein-flusst. Bis heute stellt die Sepsis das einzige Indikationsgebiet für rhAPC dar, jedoch scheint dieses multifunktionale Antikoagulanz ein weitaus größeres Einsatzspektrum zu besitzen. In diversen Tier-Modellen konnten in vivo angiogene Effekte von rhAPC nachgewiesen werden; die molekularen Grundlagen dieser Effekte sind jedoch weitgehend unbekannt. Aufgabe der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluss von rhAPC auf die Vaskulogenese (de novo-Bildung von Gefäßen) und die Angiogenese (Aussprossung von Kapillaren aus bestehenden Gefäßen) in vitro zu untersuchen sowie die molekularen und zellulären Wirkmechanismen gefäßbildender Effekte zu erforschen. Hierzu wurden im Zellkultur-experiment Stimulationsversuche mit rhAPC an endothelialen Progenitorzellen (EPCs) und humanen Endothelzellen (HUVECs) durchgeführt. Die Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung der EPCs erfolgte gemäß persönlicher Mitteilung der Gruppe Urbich/Dimmeler und in Anlehnung an ihre Veröffentlichungen (Dimmeler et al., 2001; Urbich und Dimmeler, 2004). Über Ficoll-Isolierung wurden mono-nukleäre Zellen aus „buffy coats“ isoliert und unter speziellen Bedingungen angezüchtet, die eine Ausdifferenzierung von EPCs begünstigen. Die Detektion der EPCs erfolgte durch Prüfung morphologischer und funktioneller Zelleigenschaften (LDL-Aufnahme, Lektin-Bindung) und durch den Nachweis spezifischer Oberflächenmoleküle in der FACS-Analyse. Die Zellen exprimierten die charakteristischen Marker VEGFR-2, CD34 (schwach), CD133 (schwach), CD31, vWF und CD105. Abweichend von Literaturvorgaben (Bompais et al., 2004; Smadja et al., 2006b) wurde das Adhäsionsmolekül CD146 nicht exprimiert. Da die FACS-Analyse im Vergleich zu anderen Gruppen zu einem früheren Zeitpunkt durchgeführt wurde, ist anzunehmen, dass die hier isolierten EPCs eine unreifere EPC-Population dar- stellen, die diesen Endothelzellmarker noch nicht exprimiert. Anhand von CD146 konnte hier erstmals eine Unterscheidung zwischen „frühen“ EPCs und HUVECs vorgenommen werden. Da die Wirkung von rhAPC bisher noch nicht an EPCs getestet wurde, sollte zunächst ermittelt werden, ob EPCs Effektorzellen von APC sind. Hierzu wurde untersucht, ob EPCs die für die APC-Wirkung verantwortlichen Rezeptoren (PAR-1, PAR-2, EPCR und S1P1) exprimieren. Mittels RT-PCR konnten alle genannten APC-Rezeptoren in den EPCs auf Genebene detektiert werden. Der Nachweis auf der Zelloberfläche erfolgte in der FACS- Analyse, wobei die APC-relevanten Rezeptoren, mit Ausnahme von PAR-2, darstellbar waren. In darauf folgenden Stimulationsversuchen (RT-PCR) steigerte rhAPC die Gen-expression des Rezeptors PAR-1 in EPCs. Die Expression der Rezeptoren PAR-2, EPCR und S1P1 wurde durch rhAPC nicht verändert. In weiteren Experimenten (RT-PCR, ELISA) wurde untersucht, ob rhAPC die Gen- expression bzw. die Synthese wichtiger Mediatoren der Vaskularisation beeinflusst. Hierbei bewirkte rhAPC eine Expressionssteigerung des Wachstumsfaktors „vascular endothelial growth factor-C“ (VEGF-C) in HUVECs sowie eine zeit- und dosisabhängige Erhöhung der endothelialen VEGF-C-Freisetzung. In EPCs wurde der angiogen und vaskulogen wirkende Mediator Angiopoietin-2 (Ang-2) vermehrt nach Stimulation mit rhAPC exprimiert. In einem Screening-Verfahren (Real-Time RT-PCR) wurde ein Genexpressionsprofil von EPCs nach Stimulation mit rhAPC erstellt. RhAPC zeigte hier ein indirekt proangiogenes Potential, indem es die Expression angiostatischer Gene (Interferon-γ, CXCL-Chemokin-4; -9; -10; Angiopoietin- like-4; Thrombospondin-2) verminderte und das stark angiogene Leptin hochregulierte. Daneben könnte rhAPC auch indirekt entzündungshemmend durch Herab-setzung der Expression proinflammatorischer Gene (Interferon-y; TNF; PDGF-A, CXCL-Chemokin-1; -3; -4; -5; -9 und -10, Ephrin A1- und B2) wirken. Weiterhin wurde untersucht, ob rhAPC einen Einfluss auf die Proliferation von EPCs ausübt. In Stimulationsversuchen konnte gezeigt werden, dass rhAPC die Zellzahlen von EPCs signifikant in vitro steigert. Dieser proliferative Effekt fördert die de novo-Bildung von Gefäßen, da die vaskulogene Aktivität mit der Zahl zirkulierender EPCs korreliert. Die Ergebnisse dieser Studie belegen, dass rhAPC potentiell die Entstehung neuer Gefäße vermitteln kann. Der Mechanismus der Angiogenese könnte von rhAPC indirekt aktiviert werden, indem es die Expression und Freisetzung proangiogener Wachstums-faktoren in HUVECs und EPCs steigert, während es angiostatisch wirkende Gene herab-reguliert. Erstmalig konnte hier auch eine indirekt vaskulogene Wirkung von rhAPC konsta- tiert werden, die auf einer Erhöhung der Anzahl von EPCs (Proliferationssteigerung und Mobilisierung aus dem Knochenmark durch VEGF-C und Ang-2) beruht. Zudem wurde eine indirekt antiinflammatorische Beeinflussung der Genexpression durch rhAPC festgestellt. Die vorliegende Doktorarbeit kann dazu beitragen, neue therapeutische Indikationen von rhAPC im Rahmen der Revaskularisierung ischämischer Gewebe zu erschließen (z.B. bei Traumata, kardiovaskulären Verschlusserkrankungen oder Diabetes).

The endogenous serine protease “activated protein C“ (APC) is a key regulator of blood coagulation and fibrinolysis to maintain hemostasis. In addition to its anticoagulant and profibrinolytic properties APC can also modulate inflammatory responses, because it excerts antiinflammatory and antiapoptotic activity. Therefore APC is a therapeutical option for the treatment of septic diseases, which are characterized by widespread coagulopathy and systemic inflammation. As various studies have shown, “recombinant human activated protein C” (rhAPC) can reduce the mortality in septic patients. To date severe sepsis is the only indication for rhAPC, although its multifunctional effects might have a greater therapeutic potential. Previous studies in animals already confirmed that rhAPC can promote revasculari-zation after tissue- ischemia in vivo. However, the molecular mechanisms of these angiogenic activities are still unknown. Therefore this study was aimed to discover the influence of rhAPC on vasculogenesis (de-novo-synthesis of blood vessels) and angiogenesis (sprouting of capillaries from pre-existing vessels) in vitro and to detect new molecular and cellular mechanisms for vascularization. “Endothelial progenitor cells” (EPCs) were used to examine whether rhAPC can induce vasculogenesis and “human umbilical vein endothelial cells” (HUVECs) served as a model to examine the ability of rhAPC to promote angiogenesis. Both cell-types were isolated and cultivated by the author. The isolation and characterization of EPCs was based on protocols and private information from the group around Urbich/Dimmeler (Dimmeler et al., 2001; Urbich and Dimmeler, 2004). Mononuclear cells were isolated from buffy coats by Ficoll-density- separation and cultivated under special conditions to facilitate their differentiation into EPCs. The characterization of EPCs was performed by FACS- analysis, where EPC-typical cell surface markers were detectable (VEGFR-2, CD34 (weak), CD133 (weak), CD31, vWF and CD105). In addition, morphological and functional (LDL-uptake and lectin-binding) cell-properties of EPCs were verified. In contrast to the results of other investigator groups (Bompais et al., 2004; Smadja et al., 2006b) the isolated EPCs in this study did not express the adhesion molecule CD146. One possible explanation for this could lie in the FACS-analysis being performed comparatively sooner after isolation. One can assume that these younger EPCs would represent a more pre-mature EPC- population, which would express the endothelial surface molecule CD146 in future. Using the adhesion molecule CD146 as a means to distinguish between “early” EPCs and HUVECs was performed in this study for the first time. As rhAPC has never been tested on EPCs before, it was examined, whether EPCs express the receptors which transfer the effects of APC (PAR-1, PAR-2, EPCR and S1P1). In RT-PCR-experiments the mRNA-expression of all APC-relevant receptors could be confirmed in the isolated EPCs. By using FACS-analysis these receptors were detectable on the cell surface with exception of PAR-2. In stimulation experiments (RT-PCR) rhAPC up-regulated the expression of PAR-1-mRNA in EPCs. There was no effect of rhAPC on the receptor expression of PAR-2, EPCR and S1P1. The effect of rhAPC on the expression and release of important mediators of angio-genesis and vasculogenesis was examined in HUVECs and EPCs (RT-PCR, ELISA) during subsequent experiments. Following treatment with rhAPC, HUVECs showed an increased expression of the angiogenic cytokine “vascular endothelial growth factor-C” (VEGF-C). In addition a time- and dose- dependent release of VEGF-C-protein was discovered in these cells. In EPCs rhAPC augmented the mRNA levels of the angiogenic and vasculogenic mediator angiopoietin-2 (Ang-2). The geneexpression profile of EPCs was examined following stimulation with rhAPC in a real-time RT-PCR-screening-array. The results showed a potential angiogenic effect of rhAPC by down-regulating angiostatic genes (Interferon-γ, Angiopoietin-like-4; CXCL-chemokine-4; -9; -10; Thrombospondin-2) and up-regulating the proangiogenic gene of leptin. Moreover a probable antiinflammatory effect of rhAPC could be documented by its ability to down-regulate the expression of proinflammatory genes (Interferon-y; TNF; PDGF-A, CXCL-chemokine-1; -3; -4; -5; -9; -10, Ephrin A1 and -B2). It was also examined whether rhAPC can influence the proliferation of EPCs, because vasculogenic activity highly correlates to the number of circulating EPCs. This is the first study to show that rhAPC significantly increases the number of EPCs in vitro. Summarized these in vitro results show that rhAPC may have the ability to induce blood vessel formation. RhAPC may probably promote angiogenesis because it increases the expression and the release of proangiogenic factors in HUVECs and EPCs. On the other hand it down-regulates angiostatic factors in these cells. RhAPC also might be able to induce vasculogenesis by stimulating the proliferation of EPCs and mobilizing them from the bone-marrow through VEGF-C and Ang-2. In addition a potential new antiinflammatory mechanism of rhAPC was discovered in the down-regulation of proinflammatory genes in EPCs. These results indicate various possible new indications for rhAPC as a transmitter of revascularization after ischemic tissue disease (e.g. traumata, cardiovascular diseases or diabetes).