Sensitivierung von Melanomzellen für die TRAIL-induzierte Apoptose mittels Signalwegsinhibitoren

Abstract

Das Auftreten des malignen Melanoms, der aggressivsten Form des Hautkrebses, ist in den letzten Jahrzehnten weltweit dramatisch angewachsen und wächst immer noch schneller als andere Malignitäten. Trotz steigender Inzidenzen werden die Prognosen und Überlebensraten seit den 60iger Jahren immer besser, was nicht zu Letzt an der Früherkennung und der damit verbundenen frühzeitigen chirurgischen Entfernung dünner Tumore liegt. Dessen ungeachtet, ist das metastasierte Melanom immer noch durch eine ungebrochen hohe Mortalität in Verbindung mit auftretenden Therapieresistenzen gekennzeichnet. Bis heute gibt es keine wirklich effizienten Therapien für das maligne Melanom. Die ausgeprägte Resistenz gegen Chemotherapeutika und gegen eine antitumorale Immunantwort ist häufig mit Defekten im proapoptotischen Signalweg gekoppelt. Die Überwindung der Apoptoseresistenz scheint daher ein vielversprechendes therapeutisches Ziel für das maligne Melanom zu sein. Todesliganden haben sowohl in vitro als auch in vivo ein gewisses Potential für die Krebstherapie gezeigt. Der Todesligand TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand) hat sich unter den Todesliganden als besonders vielversprechend erwiesen, da er in einer Vielzahl von Krebszellen Apoptose induzieren kann, während normalen Zellen weitestgehend unbeeinflusst bleiben. In der vorliegenden Arbeit wurden Mechanismen zur Überwindung der TRAIL-Resistenz durch verschiedene Signalwegsinhibitoren untersucht. Dies beinhaltete die PI3K-Akt/PKB-mTOR- Inhibitoren Wortmannin und Rapamycin. Neben den Todesliganden und Kinasen haben sich auch Kaliumkanäle als aussichtsreiche therapeutische Ziele herausgestellt, da sie maßgeblich an der Tumorprogression beteiligt sind. Das Triarylmethan TRAM-34, das selektiv den Ca2+-abhängigen Kaliumkanal KCa3.1 inhibiert, wurde daher ebenfalls untersucht. TRAM-34 ist in der Lage die Todesliganden-induzierte Apoptose synergistisch zu verstärken und die Resistenzen gegen TRAIL und den agonistischen CD95-Antikörper (CH-11) in einer Vielzahl von Melanomzelllinien zu überwinden, obwohl TRAM-34 selbst keine Apoptose induziert. Neben der Expression von KCa3.1-Kanälen in der Plasmamembran, die für das Melanom bereits beschrieben wurde, konnte eine KCa3.1-Expression auch in der mitochondrialen Membran nachgewiesen werden. Die Inhibition der KCa3.1-Kanäle durch TRAM-34 führte zu einer Hyperpolarisierung der mitochondrialen Membran und einer frühen Aktivierung von Bax. Genauere Untersuchungen der apoptotischen Signalwege offenbarten eine Hochregulation beider TRAIL-Rezeptoren (TRAIL-R1/DR4 und TRAIL-R2/DR5) und eine Aktivierung des intrinsischen Apoptosesignalweges. Die Kombination aus TRAM-34 und TRAIL führte zu einer starken Freisetzung der proapoptotischen, mitochondrialen Faktoren Cytochrom C, AIF und SMAC/DIABLO. Der Knockout von Bax und die Bcl-2 Überexpression blockierten die TRAM-34/TRAIL-induzierte Apoptose nahezu vollständig. Neben Bax konnte auch das Gleichgewicht zwischen den IAPs und SMAC/DIABLO als wichtig für die Regulation der TRAIL-Sensitivität nachgewiesen werden. Der siRNS-vermittelte Knockdown von SMAC führte zu einer Blockierung der TRAM-34/TRAIL-induzierten Apoptose, die Überexpression von XIAP zu einer partiellen Apoptoseblockierung. Die synergistischen Effekte von TRAM-34/TRAIL resultierten aus der Aktivierung von Bid durch TRAIL, der Aktivierung von Bax durch TRAM-34 und der massiven Freisetzung von SMAC aus den Mitochondrien durch die Kombination. Ebenso wie Kaliumkanäle, haben sich auch Komponenten des PI3K-Akt/PKB-mTOR-Signalweges als vielversprechende therapeutische Ziele zur Behandlung verschiedener Tumorentitäten erwiesen. Die Sensitivierung von Melanomzellen für die TRAIL-induzierten Apoptose durch den PI3K-Inhibitor Wortmannin und den mTOR-Inhibitor Rapamycin erwies sich als Caspasenunabhängig, korrelierte aber mit einer Aktivierung des mitochondrialen Apoptosesignalweges. Dies konnte durch die unvollständige Prozessierung der Effektorcaspase-3 sowie durch den Verlust des mitochondrialen Membranpotentials und der Freisetzung proapoptotischer Faktoren (Cytochrom C, SMAC/DIABLO und AIF) aus den Mitochondrien gezeigt werden. Die Apoptoseinduktion war entscheidend von Bax abhängig, da der Knockout von Bax und die Bcl-2 Überexpression zu einer vollständigen Blockierung der Apoptose führten. Wortmannin und Rapamycin induzieren selbst keine Apoptose, bewirken aber eine Aktivierung von Bax (Konformationsänderung), die nachgewiesen werden konnte. Die frühe Aktivierung von Bax korrelierte in hohem Maße mit Veränderungen in der charakteristischen Bax-Phosphorylierung. Beide Signalwegs-inhibitoren führten zu einer Abnahme der inaktivierenden Bax- Phosphorylierung an Serin-184 und zu einer deutlichen Verstärkung der aktivierenden Phosphorylierung an Threonin-167. Die Verstärkung der Threonin-167-Phosphorylierung konnte als abhängig von reaktiven Sauerstoffradikalen (ROS) nachgewiesen werden. Sowohl Wortmannin als auch Rapamycin führten zu einer vermehrten Produktion von ROS. Obwohl die Signalwege der ROS-vermittelten Apoptoseinduktion nach wie vor weitestgehend unbekannt sind, führte das Antioxidant α-Tocopherol (Vitamin E) zu einer partiell supprimierten Apoptose und einer verminderten Bax-Aktivierung. Dies ging mit einer verringerten Bax-Phosphorylierung an Threonin-167 einher. So wurde ein neuer Mechanismus aufgezeigt, wie ROS Apoptose, über die Beeinflussung der Bax-Phosphorylierung, kontrollieren können. Die hier gezeigten Strategien zur Sensitivierung von Melanomzellen für die TRAIL- induzierte Apoptose durch die Signalwegsinhibitoren TRAM-34, Wortmannin und Rapamycin könnten bei der Behandlung des malignen Melanoms helfen, um TRAIL- Resistenzen zu überwinden und die Wirksamkeit TRAIL-vermittelter Therapieformen zu optimieren.

The incidence of malignant melanoma, the most aggressive form of skin cancer, has grown dramatically worldwide in recent decades and is still growing faster than other malignancies. Despite increasing incidence, predictions and survival rates have been improving since the 1960s, which can be attributed to early diagnosis and early surgical removal of thin tumors. Nonetheless, the metastatic melanoma is still characterized by an unbroken high mortality in connection with therapy resistance. To date, there are no truly effective therapies for malignant melanoma. The pronounced resistance to chemotherapeutic agents as well as to an anti-tumor immune response is often related to defects in proapoptotic signaling. Overcoming apoptosis resistance therefore appears to be a promising therapeutic goal for malignant melanoma. Death ligands have demonstrated a certain potential for cancer therapy both in vitro and in vivo. The death ligand TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand) appears to induce apoptosis in a variety of cancer cell lines, while normal cells remain largely unaffected. However, melanoma cells reveal both preexisting and inducible TRAIL resistance. In the present work, mechanisms for overcoming TRAIL-resistance were examined by various signaling pathway inhibitors. These include the inhibitors of the PI3K-Akt/PKB-mTOR pathway wortmannin and rapamycin. In addition to the death ligands and kinases, potassium channels have also emerged as promising therapeutic targets because they are heavily involved in tumor progression. The triarylmethane TRAM-34, which inhibits the Ca2+-dependent potassium channel KCa3.1, was therefore also examined. TRAM-34 is capable of enhancing death ligand-induced apoptosis synergistically and to overcome the resistance to TRAIL and the agonistic CD95 antibody (CH-11) in a variety of melanoma cell lines, although TRAM-34 itself does not induce apoptosis. In addition to the expression of KCa3.1 channels in the plasma membrane, which had previously been described for melanoma, KCa3.1 expression was detected in the mitochondrial membrane. Inhibition of the KCa3.1 channels by TRAM-34 resulted in a hyperpolarization of the mitochondrial membrane and an early activation of Bax. Closer investigations of the apoptotic signaling pathways revealed upregulation of both TRAIL receptors (TRAIL-R1/DR4 and TRAIL-R2/DR5) and activation of the intrinsic apoptosis pathway. The combination of TRAM-34 and TRAIL led to a strong release of pro-apoptotic, mitochondrial factors cytochrome c, AIF and SMAC/DIABLO. The knockout of Bax and Bcl-2 overexpression blocked the TRAM-34 /TRAIL-induced apoptosis almost completely. In addition to Bax the balance between the IAPs (inhibitor of apoptosis proteins) and SMAC/DIABLO has also been shown to be important for the regulation of TRAIL sensitivity. The siRNA- mediated Knockdown of SMAC resulted in blocking of the TRAM-34/TRAIL-induced apoptosis, overexpression of XIAP to a partial blockage of apoptosis. The synergistic effects of TRAM-34/TRAIL resulted from the activation of Bid by TRAIL, activation of Bax by TRAM-34 and the massive release of SMAC from the mitochondria by the combination. As well as potassium channels, components of the PI3K-Akt/PKB-mTOR signaling pathway appear to be promising therapeutic targets for the treatment of various tumors. The present study showed that sensitization of melanoma cells to TRAIL-induced apoptosis by the PI3K inhibitor wortmannin and the mTOR inhibitor rapamycin proved to be independent of the activation of the caspase cascade, but was correlated with the activation of the mitochondrial apoptosis pathway. This was shown by the incomplete processing of the effector caspase-3 as well as by the loss of mitochondrial membrane potential and release of proapoptotic factors (cytochrome c, SMAC/DIABLO, and AIF). Apoptosis induction was critically dependent on Bax, since the knockout of Bax and Bcl-2 overexpression led to a complete blockage of apoptosis. Wortmannin and rapamycin itself does not induce apoptosis, but resulted in an activation of Bax, as was demonstrated by conformational change of Bax. Early activation of Bax correlated strongly with changes in the characteristic Bax phosphorylation. Both pathway inhibitors resulted in a decrease of the inactivating Bax phosphorylation at serine-184 and to a considerable increase of the activating phosphorylation at threonine-167. The gain of the 167-threonine phosphorylation could be detected as a function of reactive oxygen species (ROS). Both wortmannin and rapamycin led to an increased production of ROS. Although the signaling pathways of ROS- mediated apoptosis are still largely unknown, the addition of the antioxidant α-tocopherol (vitamine E) led to partially suppressed apoptosis and decreased Bax activation. This was accompanied by a decreased Bax phosphorylation at threonine-167. Thus, a new mechanism has been predicted how reactive oxygen species can control apoptosis by influencing the Bax phosphorylation. The strategies shown here for the sensitization of melanoma cells to TRAIL-induced apoptosis through the signaling pathway inhibitors TRAM-34, wortmannin and rapamycin could be helpful for the treatment of malignant melanoma to overcome TRAIL resistance and to optimize the efficiency of TRAIL-mediated therapies.