Functional and molecular biological studies of the absorption of ammonia across porcine intestinal epithelia

Abstract

The high ammonia emissions associated with pig fattening have serious consequences for the health of the animals, the people who care for them, and the global climate. For example, about 50 % of fattening pigs undergo severe pneumonia with identifiable scarring of the lung tissue in the course of their lives (Hillen et al. 2014; Maes et al. 2001; Grest et al. 1997). The source of this ammonia is degradation of protein within the gut, which is absorbed, detoxified by the liver and renally excreted. Most steps of this process have been investigated in detail. However, the mechanism by which ammonia is absorbed from the intestine continues to be unclear. Previous studies suggest that certain members of the TRP channel family contribute to uptake of ammonia in the form of NH4+ from the rumen. The aims of the present thesis were to investigate evidence for a channel-mediated uptake of NH4+ from the various parts of the porcine intestine, to study the expression of certain relevant members of the TRP family by the gut and to explore the effects of selected phytogenic agonists with a potential effect on these channels. A better understanding of the absorption mechanisms from the gastrointestinal tract of the pig is a prerequisite for the development of rational strategies in breeding and feeding with the aim of reducing ammonia excretion in fattening farms. Within the context of the two studies presented in this thesis, the expression levels of nine different TRP channels were studied and compared at mRNA level in the stomach (cardia and fundus), duodenum, jejunum, ileum, caecum and colon, always distinguishing between tissues of epithelial or muscular origin. While TRPV2, TRPV3, TRPV4, TRPV6, TRPM6, TRPM7, and TRPA1 could be detected in various segments of the porcine gastrointestinal tract, no evidence could be found for the expression of TRPV1 and TRPM8. Two channels with potential relevance for NH4+ transport, TRPV3 and TRPV4, were investigated further at protein level by immunoblot and immunohistochemistry, showing a predominant staining of the apical membrane of the epithelium in all segments. While TRPV4 was expressed throughout the gastrointestinal tract, mRNA data suggest that expression of the full-length TRPV3 protein is limited to those segments with the highest absorption of ammonia, namely caecum and colon. Via the Ussing chamber technique, functional evidence of TRPV3 and TRPV4 was obtained using the selective agonists 2-APB and GSK106790A. In line with a functional expression of these channels, electrogenic transport of NH4+ could be observed and was found to be further enhanced by the removal of divalent cations. In conjunction, the results suggest that the transport of NH4+ across the caecum and colon of the pigs may involve TRPV3, with possible further contributions of TRPV4. In the second study, the electrophysiological effects of the TRPA1 agonist cinnamaldehyde and the TRPV3 and TRPA1 agonist thymol were investigated in the colon of pigs. For this purpose, the Ussing chamber technique and the use of different blockers and solutions were used to investigate the mechanism of action in more detail. It was shown that the effect of cinnamaldehyde in the colon is most likely due to HCO3- mediated secretion by a prostaglandin-mediated signalling cascade following activation of TRPA1. In contrast, the electrophysiological effects after thymol addition were diverse, suggesting different mechanisms of action, which need to be investigated in more detail in further studies. The results presented provide an overview of the expression pattern of nine different TRP channels in seven different parts of the porcine gastrointestinal tract. Furthermore, evidence is presented for the electrogenic transport of ammonia in the form of NH4+. Functional data suggest a direct involvement of TRPV3 and TRPV4 in colonic transport, while TRPA1 modulates transport via a prostaglandin-dependent signalling cascade. By targeted modulation of these channels, e.g. by phytogenic agents, it seems possible to influence the transport and metabolism of cations, including the physiologically relevant NH4+ ion. Compounds with a selective inhibitory effects on the absorption of NH4+ from the hindgut are thus conceivable, but have yet to be developed. However, the use of currently available phytogenic agents, such as cinnamaldehyde, may result in other positive effects, such as the stimulation of bicarbonate secretion with buffering of protons in the lumen.

Die mit der Schweinemast verbundenen hohen Ammoniakemissionen haben schwerwiegende Folgen für die Gesundheit der Tiere, der Menschen, die sie versorgen, und das Weltklima. So erleiden etwa 50 % der Mastschweine im Laufe ihres Lebens eine schwere Lungenentzündung mit nachweisbarer Vernarbung des Lungengewebes (Hillen et al. 2014; Maes et al. 2001; Grest et al. 1997). Die Quelle des Ammoniaks ist der Abbau von Eiweiß im Darm, welches absorbiert, von der Leber entgiftet und über die Nieren ausgeschieden wird. Die meisten Schritte dieses Prozesses sind im Detail untersucht worden. Der Mechanismus, über den Ammoniak aus dem Darm absorbiert wird, ist jedoch nach wie vor unklar. Frühere Studien legen nahe, dass bestimmte Mitglieder der TRP-Kanalfamilie zur Aufnahme von Ammoniak in Form von NH4+ aus dem Pansen beitragen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Hinweise für eine kanalvermittelte Aufnahme von NH4+ aus den verschiedenen Teilen des Schweinedarms zu überprüfen, die Expression bestimmter relevanter Mitglieder der TRP-Familie im Darm zu ermitteln und die Auswirkungen bestimmter phytogener Agonisten mit potenzieller Wirkung auf diese Kanäle zu untersuchen. Ein besseres Verständnis der Absorptionsmechanismen aus dem Magen-Darm-Trakt des Schweins ist eine Voraussetzung für die Entwicklung rationaler Strategien in der Zucht und Fütterung mit dem Ziel, die Ammoniakausscheidung in Mastbetrieben zu reduzieren. Im Rahmen der beiden in dieser Arbeit vorgestellten Studien wurden die Expressionsniveaus von neun verschiedenen TRP-Kanälen auf mRNA-Ebene in Magen (Kardia und Fundus), Duodenum, Jejunum, Ileum, Zäkum und Kolon untersucht und verglichen, wobei zwischen den Geweben auf epithelialem oder muskulärem Ursprung unterschieden wurde. Während TRPV2, TRPV3, TRPV4, TRPV6, TRPM6, TRPM7 und TRPA1 in verschiedenen Segmenten des Magen-Darm-Trakts von Schweinen nachgewiesen werden konnten, gab es keine Hinweise auf die Expression von TRPV1 und TRPM8. Zwei Kanäle mit potenzieller Relevanz für den NH4+-Transport, TRPV3 und TRPV4, wurden auf Proteinebene mittels Immunoblot und Immunhistochemie weiter untersucht und zeigten eine überwiegende Färbung der apikalen Membran des Epithels in allen Segmenten. Während TRPV4 im gesamten Gastrointestinaltrakt exprimiert wurde, deuten die mRNA-Daten darauf hin, dass die Expression des TRPV3-Proteins in voller Länge auf die Segmente mit der höchsten Ammoniakaufnahme, nämlich Zäkum und Kolon, beschränkt ist. Mit Hilfe der Ussing-Kammertechnik wurde ein funktioneller Nachweis von TRPV3 und TRPV4 unter Verwendung der selektiven Agonisten 2-APB und GSK106790A erbracht. Im Einklang mit einer Expression dieser Kanäle konnte ein elektrogener Transport von NH4+ beobachtet werden, der durch die Entfernung von zweiwertigen Kationen noch verstärkt wurde. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass am Transport von NH4+ durch das Zäkum und dem Kolon von Schweinen TRPV3 beteiligt sein könnte, wobei TRPV4 möglicherweise weitere Beiträge leistet. In der zweiten Studie wurden die elektrophysiologischen Wirkungen des TRPA1-Agonisten Zimtaldehyd und des TRPV3- und TRPA1-Agonisten Thymol im Kolon von Schweinen untersucht. Zu diesem Zweck wurde die Ussing-Kammertechnik und die Verwendung verschiedener Blocker und Lösungen eingesetzt, um den Wirkungsmechanismus genauer zu untersuchen. Es zeigte sich, dass die Wirkung von Zimtaldehyd im Dickdarm höchstwahrscheinlich auf eine HCO3- vermittelte Sekretion durch eine Prostaglandinvermittelte Signalkaskade nach Aktivierung von TRPA1 zurückzuführen ist. Im Gegensatz dazu waren die elektrophysiologischen Effekte nach Thymol-Zugabe vielfältig, was auf unterschiedliche Wirkmechanismen hindeutet, die in weiteren Studien noch genauer untersucht werden müssen. Die vorgestellten Ergebnisse geben einen Überblick über das Expressionsmuster von neun verschiedenen TRP-Kanälen in sieben verschiedenen Teilen des Magen-Darm-Trakts von Schweinen. Darüber hinaus gibt es Hinweise auf den elektrogenen Transport von Ammoniak in Form von NH4+. Funktionelle Daten deuten auf eine direkte Beteiligung von TRPV3 und TRPV4 am Transport im Kolon hin, während TRPA1 den Transport über eine Prostaglandin-abhängige Signalkaskade moduliert. Durch gezielte Modulation dieser Kanäle, z. B. durch phytogene Wirkstoffe, scheint es möglich, den Transport und den Stoffwechsel von Kationen, einschließlich des physiologisch relevanten NH4+-Ions, zu beeinflussen. Wirkstoffe mit einer selektiven Hemmwirkung auf die Absorption von NH4+ aus dem Dickdarm sind daher denkbar, müssen aber noch entwickelt werden. Die Verwendung derzeit verfügbarer Phytogene, wie z.B. Zimtaldehyd, kann jedoch zu anderen positiven Effekten führen, wie z.B. zur Stimulation der Bikarbonatsekretion mit Pufferung von Protonen im Lumen.