Minimale Resterkrankung beim kolorektalen Karzinom: Nachweis disseminierter Tumorzellen in peripheren Blutproben und Knochenmarkaspiraten mittels quantitativer RT-PCR

Abstract

Das kolorektale Karzinom ist in frühen Tumorstadien eine gut behandelbare und potentiell heilbare Erkrankung. Dennoch erleiden etwa 20-40% der Patienten, die mit einem Tumorstadium I oder II in kurativer Absicht operiert wurden, ein Rezidiv, wobei in der Mehrzahl der Fälle Lebermetastasen auftreten. Der Nachweis disseminierter Tumorzellen könnte helfen, Patienten für eine adjuvante Therapie zu selektieren.

In dieser Arbeit wurde die Methode der quantitativen RT-PCR mit sechs verschiedenen mRNA- Markern (CEA, CK20, ProtM, WT1, A33, RegIV) für den Nachweis einer minimalen Resterkrankung beim kolorektalen Karzinom evaluiert. Vorversuche an Kolonkarzinom-Gewebsproben und Zelllinien ergaben eine hohe Expression von CEA und CK20 in Gewebsproben sowie von ProtM in Zelllinien. Alle Marker waren in Blutproben gesunder Spender sowie in Proben von Patienten mit entzündlichen Erkrankungen nachweisbar (ProtM: 22,5%, CEA: 83,7%, CK20: 84,6%, WT1: 22,7%, A33, RegIV: 100%). Aufgrund der hohen Exression von A33 und RegIV in Gesundblut wurden diese Marker nicht weiter untersucht. Die Untersuchung von 237 peripheren Blutproben von 129 Patienten mit kolorektalem Karzinom ergab, daß ProtM-Transkripte in 17%, CEA in 86%, CK20 in 88,4% und WT1 in 46,5% der Patientenblutproben detektiert wurden.

Zur Differenzierung zwischen der Hintergrundexpression der Marker in hämatopoetischen Zellen von dem Anteil, der von Tumorzellen stammen könnte, wurden über die Quantifizierung der Hintergrundexpression Grenzwerte eingeführt. Unter Berücksichtigung der Grenzwertstrategien wurden lediglich 13,2% der Patienten als positiv für mindestens einen der Marker evaluiert. Eine stark erhöhte Marker-Expression (mehr als das 5-fache der Hintergrund- Expression) wurde in nur sechs Blutproben gefunden. Weiterhin konnte kein Zusammenhang zwischen Krankheitsstadium und Höhe oder Häufigkeit der Markerdetektion gefunden werden. Für 19 Patienten konnten sowohl prä- als auch postoperativ Blutproben gewonnen werden, wobei zwei Patienten erhöhte postoperative Marker-Konzentrationen aufwiesen. Die Untersuchung von 10 Knochenmarksaspiraten von Patienten mittels quantitativer RT-PCR und Immunzytologie konnte keinen Tumorzellnachweis erbringen.

Trotz des hohen Expressionsniveaus von CEA, CK20 und ProtM in Gewebsproben bzw. Zelllinien konnte in dieser Arbeit keine befriedigende Differenzierung zwischen RNA-Markern, die von Tumorzellen oder von hämatopoetischen Zellen stammen, erhalten werden. Die Ergebnisse legen nahe, daß entweder die Anzahl der mRNA-Kopien der verwendeten Marker in zirkulierenden Tumorzellen zu klein ist oder, wahrscheinlicher, daß das periphere Blut kein geeignetes Kompartiment für den Nachweis einer minimalen Resterkrankung beim kolorektalen Karzinom darstellt.

The detection of disseminated tumor cells in peripheral blood and bone marrow from colorectal cancer patients by RT-PCR could be an attractive method for selecting patients for adjuvant therapy.

We here report on real-time RT-PCR assays (LightCycler) to quantitate six potential mRNA markers (CEA, CK20, ProtM, WT1, A33, RegIV) in order to evaluate minimal residual disease in colorectal cancer. We investigated specimens from colon carcinoma and normal colon mucosa tissues, cell lines, blood samples from 129 patiens with colorectal cancer (all stages), and 58 reference blood samples (healthy donors, persons suffering from inflammatory bowel or infectious diseases), as well as bone marrow aspirates (10 patients with colorectal cancer, 20 reference samples).

The expression profile in tissues showed high values for CEA and CK20 whereas in cell lines ProtM was predominant. All markers were detected in reference and patient blood samples (ProtM: 22/17%, CEA: 84/86%, CK20: 85/88%, WT1: 22/46%, A33, RegIV: 100/100% ). Due to the high expresstion of A33 and Reg IV in hematopoetic cells, these markers were omitted from analysis.

After quantitative analysis, the definition of cut-off values for each marker, and the combination of markers 13% of patients were judged to have elevated marker concentrations in their blood from which only 6 had values significantly differing from cut-off value. There were no differences between stages of disease. In the case of 19 patients, investigated prior to and one week after surgery, 2 samples revealed a significant postoperative increase in CEA or CK20 mRNA concentration. The investigation of the bone marrow aspirates by RT-PCR and immuncytology did not show evidence for disseminated tumor cells.

In spite of high expression levels in tissues and cell lines, we were not able to satisfyingly differentiate mRNA markers originating from tumor cells and those from illegitimate transcription in hematopoetic cells in blood. We conclude that either copy numbers of analysed markers in circulating tumor cells are not sufficient for detection or, more probably, that peripheral blood is not a suited compartment for detection of tumor cells in colorectal cancer.