Das Infektiöse Bronchitis Virus (IBV): Molekularbiologische Untersuchungen zur Diagnostik und zum Vorkommen sowie zur Pathogenität des Genotyps IBV QX in spezifisch pathogenfreien (SPF) Broilern

Abstract

Zum universellen und routinemäßigen Nachweis des Infektiösen Bronchitis Virus (IBV) wurde im ersten Teil der vorliegenden Doktorarbeit eine duplex Real-time Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion (RT-qPCR) unter Verwendung einer heterologen internen Kontrolle (IK) etabliert. Dabei ermöglichte die Lokalisation der IBV spezifischen Primer und Sonde innerhalb hochkonservierter Bereiche des Matrixprotein- Gens eine sichere Detektion verschiedener IBV Genotypen und Stämme. Als IK diente eine enhanced green fluorescent protein (EGFP) in vitro RNA. Durch Zugabe der IK direkt zum Probenmaterial vor der extraktionkonnten falsch negative Ergebnisse auf Grund fehlerhafter RNA- Extraktion und / oder infolge von PCR Inhibitoren sicher ausgeschlossen werden. Bei der Überprüfung der Sensitivität anhand eines RNA in vitro Standards ergab sich eine Nachweisgrenze von 20 Kopien/Reaktion. Die Spezifität des Verfahrens wurde durch Untersuchung weiterer viraler bzw. bakterieller geflügelrelevanter Atemwegserreger und SPF Trachealtupfernproben von SPF Huhnern belegt. Die diagnostische Anwendbarkeit des Testverfahrens wurde darüber hinaus durch Untersuchung von Feldproben bestätigt. Dabei konnte die IK in IBV negativen Feldproben sicher amplifiziert werden, während sich bei IBV positiven Proben kein negativer Einfluss auf die IBV Amplifikation ergab. Die Genotypisierung nachgewiesener IBV Stämme erfolgte in einem ersten Schritt anhand zweier typspezifischer RT-PCRs zum Nachweis von IBV 4/91 und IBV QX. Zur weiteren Differenzierung wurde ein System auf Basis verschiedener RT-PCRs und nested- PCRs, die verschiedene Fragmente innerhalb des S1 Protein Gens amplifizieren, mit nachfolgender Restriktionsenzymanalyse (REA) und Sequenzanalyse entwickelt. Bei der Untersuchung von Feldproben konnten mittels des entwickelten Differenzierungssystems neben IBV 4/91 und QX verschiedene Vertreter des Massachusetts Genotyps als auch der Genotyp D274 erfolgreich differenziert werden. In zweiten Teil der Arbeit erfolgte eine epidemiologische Auswertung des im Rahmen der IBV Routinediagnostik in den Jahren 2004 bis 2009 eingesandten Probenmaterials. Über den gesamten Untersuchungszeitraum hinweg wurde IBV in 42,5 % der untersuchten Proben nachgewiesen, wobei eine Unterscheidung zwischen Feld- und Impfstämmen nicht erfolgen konnte. Bei Analyse der jährlichen Nachweisraten waren insbesondere Untersuchungsgründe als auch untersuchte Nutzungsrichtungen zu berücksichtigen. So korrelierte die relativ hohe Nachweisrate im Jahr 2009 insbesondere mit der hohen Nachweisrate bei Broilern. Eine weitere Analyse der zurzeit wichtigsten in Deutschland zirkulierenden Genotypen IBV 4/91 und QX unterstreicht die derzeit besondere Bedeutung des Gesnotyps IBV QX, der in mehr als der Hälfte der positiven Einsendungen mit insgesamt eher steigender Tendenz detektiert werden konnte. Davon waren in besonderem Maße Broilerbestände und erst zu Ende des Untersuchungszeitraums auch vermehrt Legehennenbestände betroffen. Für den Genotyp IBV 4/91 zeigte sich dagegen zu Ende der Untersuchungen ein deutlicher Rückgang des Anteils positiver Proben insbesondere bei Legehennen. Im letzten Teil der Arbeit wurden in vivo Untersuchungen zur Pathogenität des Genotyps IBV QX bei SPF Broilerküken durchgeführt. Dabei waren nach okulonasaler Infektion sowohl klinisch als auch pathologisch anatomisch Anzeichen einer Nephritis zu beobachten, was eine Klassifizierung des Isolats als nephropathogenen Stamm erlaubte. Untersuchungen zur Ausbreitung des Virus im Organismus und zur Virusausscheidung mittels RT-qPCR belegten darüber hinaus den weiten Gewebstropismus als auch die schnelle Ausbreitung von IBV QX im Körper in Kombination mit einer wiederum schnellen Virustilgung in betroffenen Organen. Hinsichtlich der Virusausscheidung fand sich eine längere und mit höheren Viruslasten verbundene Ausscheidung über den Kot als über den Respirationstrakt. In Anbetracht Ihrer Diagnostiktauglichkeit sprechen diese Ergebnisse damit dafür, dass insbesondere zu einem späteren Zeitpunkt nach Infektion Kloakentupfer das beste Untersuchungsmaterial zum Nachweis von IBV QX darstellen. Organproben sind dagegen nur in einem relativ schmalen Zeitfenster zur Diagnostik geeignet. Dabei ist die RTqPCR ein geeignetes diagnostisches Verfahren, welches neben dem Nachweis auch eine Quantifizierung der Viruslast ermöglicht.

In the first part of this study a duplex real time reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-qPCR) with a heterologous internal control (IC) was established as a tool to detect RNA of the Infectious Bronchitis Virus (IBV) in routine diagnostics. The localization of primers and probe within a highly conserved region of the matrix protein gene allowed a reliable detection of different IBV genotypes and strains. As IC an in vitro RNA of the enhanced green fluorescent protein (EGFP) was used. It was directly added to investigate field samples before RNA extraction in aim to exclude false negative results due to faulty RNA extraction and/or PCR inhibitors. The detection limit of RT-qPCR using an in vitro RNA standard was determined to be 20copies/reaction. The specificity of the new method was checked using further avian viral and bacterial respiratory pathogens as well as tracheal swabs from specific pathogen free (SPF) chickens. In addition, the diagnostic applicability of the established method was determined by examination of field samples. While in IBV negative samples a reliable IC amplification was observed, IC did not have a negative influence IC on the amplification of IBV positive samples. Molecular genotyping of IBV strains was firstly carried out by using two genotype-specific RT-PCRs amplifying the IBV genotypes 4/91 and QX, respectively. For further genotyping a system was developed based on several RT-PCRs and nested PCRs amplifying different fragments within the S1 protein gene coupled with restriction enzyme analysis (REA) and genetic sequencing. By examinations of field samples using this system besides IBV 4/91 and QX genotypes, other genotypes like D274 and Massachusetts as well as some strains belonging to the Massachusetts genotype were successfully differentiated. In the second part of this study field samples submitted to IBV routine diagnostic between 2004 and 2009 were investigated epidemiologicaly analyzed. IBV-RNA was detected in 42.5 % of examined samples. However, differentiation between field and vaccine strains could not be achieved. By analysing annual detection rates of IBV several factors should be considered such as the reason of the investigation (monitoring / diagnosis) as well as the type of production (broilers, breeders, layers). The relatively high IBV detection rate in 2009 was correlated with the high detection rate in broilers. The current major circulating genotypes in Germany are 4/91 and QX IBV. The results revealed that the gentype OX is the currently the most detected type and was found in more than 50 % of IBV positive field samples with increasing tendency. Chicken broiler flocks were particularly affected by QXIBV, but in later years the number of affected layer flocks was increased as well. In contrast, at the same time a clear decline of the detection rate of genotype 4/91was observed especially in layers. In the last part of this work an in vivo experiment was carried out in SPF broilers to investigate the pathogenicity of an isolate of the IBV genotype QX. After oculo-nasal infection clinical sings and pathological manifestations indicating nephritis were observed. This allowed a classification of this isolate as nephropathogen. The viral dissemination in the organism and its shedding as investigated by RT-qPCR gave evidence for a broad tissue tropism as well as a rapid spread of QX IBV in the body in combination with a rapid viral elimination in the affected organs. The faeces showed a longer and higher viral load in comparison with the respiratory tract. These results of virus shedding suggest that cloacal swabs are the more appropriate material for diagnostic of QX IBV at a later time after infection. In contrast, organ samples are suitable for diagnosis only in a relatively short time interval. Furthermore, RT-qPCR proved to be a suitable diagnostic method not only for detection of IBV but also for quantification of viral load.