Humane demineralisierte Knochenmatrix (DBM) im Tissue Engineering von humanem Knorpelgewebe

Abstract

Traumatische, tumoröse oder kongenitale Läsionen im Bereich des Kopfes erfordern eine Rekonstruktion nicht nur aus funktionellen, sondern auch aus ästhetischen Gesichtspunkten. Das Tissue Engineering ist eine wertvolle Methode, um aus wenigen autologen Zellen mit Hilfe eines Biomaterials größere Gewebestrukturen herzustellen. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich deshalb mit dem viel versprechenden Biomaterial der humanen demineralisierten Knochenmatrix (DBM), die bereits erfolgreich seit Jahren zur Reparatur von Knochendefekten in der Unfall- und Kieferchirurgie, aber auch Hals-Nasen- Ohrenheilkunde eingesetzt wird. Der Mangel an ausreichenden in-vitro Arbeiten, die die Kultivierung von Knorpelzellen in der DBM genauer untersuchen, machen vor dem tierexperimentellen und klinischen Einsatz weitere in-vitro Arbeiten notwendig. In dieser Arbeit wurde die Besiedlung der DBM mit humanen Chondrozyten untersucht und die Interaktion der Knorpelzellen mit der DBM in Hinblick auf einen möglichen proliferationshemmenden oder toxischen Effekt der DBM analysiert. Die einfache Besiedlung von humanen Chondrozyten in der großporigen DBM gelang nur vereinzelt, da es zu einer mangelnden Redifferenzierung und zum Zelltod kam. Deshalb erfolgte eine Besiedlung der DBM mit Chondrozyten-Makroaggregaten. In den histologischen und immunhistochemischen Färbungen konnte die Adhäsion und Proliferation der Chondrozyten-Makroaggregate in der DBM gezeigt werden. Doch im Gegensatz zu den Kontrollknorpelzellen, die nicht mit der DBM in Kontakt kamen, imponierten in der DBM morphologisch veränderte Zellen mit überwiegender Expression von Kollagen I. Die Redifferenzierung mit einer Wiederaufnahme der Expression von Kollagen II konnte nur in geringem Maße nachgewiesen werden. Der immunhistochemische Nachweis des Apoptosemarkers Caspase III in den Zell-DBM- Konstrukten und den Makroaggregaten, die mit dem Medium der DBM kultiviert wurden, legt die Induktion von Apoptose in den Chondrozyten durch die DBM nahe. Unter dem Verdacht auf eine Freisetzung toxischer Substanzen aus der DBM, u.a. von in der Aufarbeitung verwendeter Peressigsäure und Chloroform, wurden Untersuchungen des Zellkulturmediums durchgeführt. Rest¬bestände von Peressigsäure und Chloroform ließen sich mit den verwendeten Detektionssystemen nicht nachweisen. In einem weiteren Versuchsteil wurde mittels zweier Proliferationstests die Vitalität der Chondrozyten in Abhängigkeit von der Kulturdauer und Konzentration von DBM im Bezug zu einer Gruppe von Kontrollchondrozyten bestimmt. In den ersten 48 Stunden bestand mit steigender Konzentration der DBM ein Trend zu höheren Proliferationsraten und Vitalität der Chondrozyten im Vergleich zur Kontrolle. Nach 96 Stunden sanken die Werte dosisabhängig unter die der Kontrollzellen. Die parallel durchgeführten Vitalfärbungen, mittels der Lebend- (FDA-) und Tot- (PI-) Darstellung stimmen mit den Ergebnissen der Proliferationstests überein. Der immunhistochemische Nachweis von Caspase III, die sinkende Vitalität nach 96 Stunden im ELISA und die Anzahl an toten Zellen in den Vitalfärbungen sind nicht allein mit der Freisetzung von toxischen Restbeständen aus der DBM erklärbar. In den Grundlagenarbeiten von Urist et al. (1979) konnte die Freisetzung von chondrogen wirkenden Wachstumsfaktoren aus der DBM gezeigt werden. Der Verbrauch der Wachstumsfaktoren durch die Zellen, der steigende Bedarf durch die starke anfängliche Proliferation und der Wechsel des kompletten CGM alle zwei Tage, könnte nach 48 Stunden zum Entzug von Wachstumsfaktoren, welcher die Einleitung der Apoptose bedingen kann und damit zum immunhistochemischen Nachweis von Caspase III und sinkenden Proliferationsraten im ELISA geführt haben. Prinzipiell ist DBM als Trägermaterial im Tissue Engineering für humane Chondrozyten geeignet, doch die mangelnde Redifferenzierung und die Einleitung der Apoptose machen sowohl weitere toxikologische Untersuchungen als auch Arbeiten mit dem Einsatz von Wachstumsfaktoren notwendig.

The reconstruction of traumatic, tumorous or congenital lesions in regiones of the head is necessary because of functional and aesthetic reasons. Tissue Engineering ist an important method for cultivating some few autologous cells with help of biomaterials. That is why this work examinates the hopefullness biomaterial of human demineralized bone matrix (DBM), which has been used for many years for reconstruction of bone in orthopaedic surgery, but also in otorhinolaryngology. For lack of in-vitro studies, analysing the cultivation of chondrocytes in DBM, more in vitro analysis are necessary before application in animal or clinical studies. In this work the seeding of chondrocytes in the DBM and its interaction with the DBM was tested in view of a possible inhibitory effect of the proliferation or toxicity of the DBM. The colonisation of human chondrocytes in the large pores of the DBM succeeded only isolated because of missing redifferentiation and cell death. Therefore DBM was populated with macroaggregates of chondrocytes. In the histological and immunhistochemical coloration the proliferation and adhesion of the cell – macroaggregates was shown in the DBM. In contrast to a controll group, cells which were not cultivated with DBM, impressed in the DBM morphological modified cells with expression of collagen I. The redifferentiation with reuptake of expression of collagen II was found in low amounts only. The detection of caspase III, a marker of apoptosis, in the cell-DBM-constructs and in the macroaggegates, cultivating with the medium of DBM, suggested the induction of apoptosis in the chondrocytes by DBM. Because of having the suspicion of the release of toxic agents of the DBM for example peracetic acid or chloroform, explained throw the sterilisation process, the cell culture medium was analysed. But neither peracetic acid nor chloroform were verified. In another experimental setting the vitality of chondrocytes depending on culture time and concentration of DBM was analized by two different proliferation tests with reference to a control group. Higher concentration of DBM tended to result in higher proliferation rates and vitality of the cells in contrast to the control group in the first 48 hours. After 96 hours the vitality sank dose-dependent below the control group. The synchronously performed vitality stain by vital (FDA) and non-vital (PI) coloring corresponded with the results of the proliferation tests. The detection of Caspase III, the decreasing vitality after 96 hours and the death cells are not only explained by the release of toxic agents of the DBM. The fundamental works of Urist et al. (1979) have shown the release of growth factors by the DBM, which induces the chondrogenesis. The consumption of growth factors by cells, the increasing need because oft he high proliferation rate in the beginning and the complete change oft he cell culture medium each two days, could lead to a lack of growth factors after 48 hours, which induced the apoptosis associated with the immunhistochemical detection of Caspase III and decreasing proliferation rates in ELISA analysis. In principle DBM is qualified as scaffold for Tissue Engineering of human chondroncytes. But the insufficient redifferentiation and the initiation of apoptosis necessitate further toxicological examinations as well as the use of growth factors.