Isolation and analysis if the embryonic lethal mutation tw18

Abstract

t haplotypes are naturally occurring variants of a 40 Mb region on the proximal portion of mouse chromosome 17 which can affect embryonic development, among other things. The tw18 haplotype carries a lethal factor which causes defects in cell lineage differentiation during gastrulation, resulting in embryonic lethality between E8.5 and E10.5. Previous work identified a large deletion in the tw18 haplotype presumed to contain the gene causing the homozygous phenotype. In this work, using next generation sequencing and PCR analyses, the borders of this deletion were precisely mapped. This revealed a region of 4.3 Mb containing 74 genes, among which Ppp2r1a was identified as a candidate gene. Ppp2r1a encodes for the scaffolding subunit A of protein phosphatase PP2A. Loss of Ppp2r1a function was shown to phenocopy the tw18 homozygous phenotype. In addition, expression of Ppp2r1a from a BAC transgene introduced into the tw18 homozygous background was able to rescue gastrulation defects and overcome embryonic lethality. Taken together, these results confirm Ppp2r1a as the gene responsible for the tw18 phenotype. Gene expression profiling of E6.5 embryos revealed a function for PPP2R1A in regulating Wnt and Nodal signaling. In embryos lacking Ppp2r1a, dysregulation of these pathways resulted in failure to induce the mesendodermal cell fate, and enhanced cell adhesion, causing cells to become trapped in the primitive streak. An in vitro mass spectrometry approach to analyze the PPP2R1A interaction network showed interaction of PPP2R1A with B regulatory subunits of PP2A that are involved in regulating Wnt and Nodal signaling, which further supports a function for PPP2R1A in the regulation of these signaling cascades.

t-Haplotypen sind natürlich vorkommende Varianten einer 40 Mb großen Re- gion im proximalen Teil von Chromosom 17 der Hausmaus, die unter anderem die Embryonalentwicklung beeinflussen können. Der tw18-Haplotyp trägt eine letale Mutation, die Defekte während der Gastrulation und Letalität zwischen Tag 8.5 und 10.5 während der Entwicklung hervorruft. Eine große Deletion wurde vorgeschlagen, das Gen zu enthalten, das den homozygoten tw18 Phänotyp verursacht. Durch Genomsequenzierung und PCR-Analysen konnten die Grenzen der Deletion präzise bestimmt werden. Dies zeigte eine 4.3 Mb große deletierte Region, die 74 Gene enthält. Unter diesen 74 Genen wurde Ppp2r1a, das für die Strukturuntereinheit A der Proteinphosphatase PP2A codiert, als Kandidatengen isoliert. Der Funktionsverlust des Gens erzeugt Embryonen, deren Phänotyp dem von tw18-Homozygoten entspricht. Es ist außerdem möglich, den tw18-Phänotyp durch Expression eines Ppp2r1a-BAC-Transgens zu komplementieren. Diese Ergebnisse bestätigen Ppp2r1a als das für den tw18-Phänotypen verantwortliche Gen. Transkriptomanalysen von mutanten Embryonen an Tag 6.5 zeigen, dass Ppp2r1a während der Gastrulation an der Regulierung wichtiger Signalwege, wie Wnt und Nodal beteiligt sein könnte. In Embryonen denen Ppp2r1a fehlt, führt die Deregulierung dieser Signalkaskaden dazu, dass einerseits mesendodermale Zelllinien nicht spezifiziert werden können und andererseits Zellen durch verstärkte Zelladhäsion, den Primitivstreifen nicht verlassen können. Dem Gegenüber konnte in in vitro-Massenspektrometrieversuche gezeigt werden, dass PPP2R1A mit PP2A B regulatorischen Untereinheiten interagiert, die an der Regulierung von Wnt- und Nodal-Signalwegen beteiligt sind. Dies bestätigt, dass PPP2R1A ebenfalls eine Funktion in der Regulierung dieser Signalkaskaden hat.