Die vorliegende Arbeit wurde mit dem Ziel der Herstellung stabiler liposomaler Gentransfervesikel für den in vitro und in vivo Gentransfer angefertigt. Diese Vesikel sollen auch für eine klinische Anwendung am Menschen geeignet sein. Anforderungen an solche Vesikel sind: hohe Transfereffizienz, Stabilität und Sicherheit für Patient und Anwender.
Die Arbeit beinhaltete Untersuchungen zu der Herstellung, den biophysikalischen Eigenschaften, der in vitro Gentransfereffizienz sowie zur Stabilität und Lagerfähigkeit der Gentransfervesikel.
Die Ergebnisse zeigen, daß die Gentransfereffizienz von folgenden Faktoren beeinflußt wird: den Bestandteilen der Gentransfervesikel, der Herstellung der Vesikel, dem Ablauf der Transfektion, der Zellart und deren Kulturbedingungen. Bezüglich der Vesikelbestandteile wurde festgestellt, daß sich für hohe in vitro Transfektionsraten Lipide mit einer Sperminkopfgruppe besonders eignen. Die aus solchen Lipiden hergestellten liposomalen Gentransfervesikel sind jedoch nur kurzzeitig aktiv und für eine längere Lagerung nicht geeignet.
Dagegen waren aus monokationischen Lipiden (DAC-Chol) hergestellte Liposomen für eine Formulierung von längerfristig stabilen Gentransferkomplexen geeignet. Die Effizienz und Lagerfähigkeit dieser Vesikel konnte durch den Zusatz von Protaminsulfat noch gesteigert werden. Eine weiter erhöhte Stabilität und die Möglichkeit eines Einfrierens der vorformulierten Gentransferkomplexe wurde durch den Zusatz von Saccharose ermöglicht. Saccharose senkte jedoch die Kurzzeitaktivität der Gentransfervesikel auf etwa ein Drittel der Aktivität von Gentransfervesikeln, welche ohne Zuckerzusatz hergestellt worden waren. Die verringerte Kurzzeitaktivität konnte durch eine erhöhte Dosierung der Gentransferkomplexe ausgeglichen werden. Die Untersuchungen zeigen, daß die Verwendung von Lipid/Protaminsulfat/DNA- Komplexen, welche in saccharosehaltiger Lösung hergestellt wurden, einen effektiven Gentransfer in vitro gewährleistet und ein vielversprechender Ansatz für in vivo Untersuchungen sowie mögliche klinische Anwendungen ist.
The aim of this work was the preparation of stable liposomal gene transfer vesicles for the in vitro and in vivo gene transfer. It should be possible to use these vesicles for clinical issues on humans. The requirements for such vesicles are: high efficiency, stability and security for the user and the patient.
The work contained investigations to the production, the biophysical characteristics, that in vitro gene transfer efficiency as well as for stability and shelf-life of the gene transfer vesicles.
Our results show that the gene transfer efficiency is in uenced by the following factors: the constituents of the gene transfer vesicles, the production of the vesicles, the ow of the transfection, the cell type and their culture conditions.
Concerning the vesicle constituents it was stated that for high in vitro transfection rates lipids with a spermin headgroup are particularly suitable. Out such lipids manufactured liposomal gene transfer vesicles are however only briefly active and for a longer storage not suitably.
On the other hand from monocationic lipids (DAC-Chol) manufactured liposomes were suitable for the preparation of long term stable gene transfer complexes. The efficiency and shelf-life of these vesicles could be still increased by the addition of protaminsulfate. An even more increased stability and the possibility of freezing the preformulated gene transfer complexes was enabled by the addition of saccharose. Saccharose lowered however the short time activity of the gene transfer vesicles to a third of the activity of gene transfer vesicles, which had been manufactured without sugar addition. However the reduced short time activity could become balanced by an increased dosage of the gene transfer complexes. The investigations show that the use of lipid/protaminsulfate/DNA complexes, which were manufactured in a saccharose containing solution ensures an effective gene transfer in vitro and a promising beginning for in vivo investigations as well as possible clinical applications is.
