Analyse und Vorhersage der Wechselwirkungen von Protein-Interaktionsdomänen

Abstract

Beinahe alle zellulären Prozesse hängen von fein abgestimmten Protein-Protein- Wechselwirkungen ab. Ein nicht unwesentlicher Teil dieser Wechselwirkungen wird durch eine relativ kleine Anzahl sequentiell und strukturell konservierter Protein-Interaktionsdomänen über meist konservierte Wechselwirkungsmechanismen vermittelt. Einige dieser Wechselwirkungen sind auch interessante Angriffspunkte für neue pharmakologische Interventionsstrategien. In dieser Arbeit wurden qualitative und quantitative Wechselwirkungsmodelle auf der Sequenz-, Struktur- und Komplexstrukturebene erstellt, um die Bindungs- und Spezifitätsmechanismen zu verstehen und neue potentielle Wechselwirkungen für Protein-Interaktionsdomänen (WW- und PDZ-Domänen) vorherzusagen. Diese statistischen Modelle wurden auf der Basis experimenteller Wechselwirkungsdaten aus den Screenings von 42 WW-Domänen bzw. 3 PDZ-Domänen mit Peptidbibliotheken trainiert. Für WW-Domänen konnte auf Sequenzebene ein Klassifizierungssystem entwickelt werden, welches zum ersten Mal die umfassende Klassifizierung sowohl der WW- Domänen als auch ihrer prolinreichen Liganden allein an Hand ihrer Sequenzen in die folgenden 6 Spezifitätsgruppen erlaubt: die Y-Spezifitätsgruppe ist durch das xPPxY-Erkennungsmotiv charakterisiert, die Ra-Gruppe durch das (P/F/I/V)P(P/G)PPPR-Motiv, die Rb-Gruppe durch das PPPRGPPP-Motiv, die L-Gruppe durch das PPLPP-Motiv, die Phosphoserin(poS)/Phosphothreonine(poT)-Gruppe durch das (poT/poS)P-Motiv und die poly-P-Gruppe durch das (P/I/V/L)PPPPP-Motiv. Da für 5 der 6 Spezifitätsgruppen die spezifitätsbestimmenden Reste auch in den Domänen identifiziert wurden, konnten 66 % aller 482 bekannten WW-Domänen (SMART- Datenbank, Stand: 15.11.2001) einer der Spezifitätsgruppen zugeordnet werden. Die vorhergesagte Tyrosin-Spezifität für 3 WW-Domänen mit bislang unbekannter Spezifität konnte anschließend experimentell bestätigt werden. Für Wechselwirkungsmodelle auf Struktur- und Komplexstrukturebene wurden die 3D-Strukturen aller 42 in dieser Arbeit experimentell untersuchten WW-Domänen durch Homologie-Modellierung generiert. Darüber hinaus wurden Komplexstrukturmodelle für jede der 6 Spezifitätsgruppen auf der Basis systematischer Analysen der Erkennungsmotive (Substitutionsanalysen) entwickelt. Damit konnte erstmals eine in sich konsistente Hypothese über den Mechanismus der Bindung argininhaltiger Liganden durch WW-Domänen der Ra\- und Rb-Spezifitätsgruppen vorgeschlagen werden. Auf der Basis dieser modellierten Strukturen der WW-Domänen wurde ein quantitatives Struktur-Aktivitäts-Modell der Tyrosin-Spezifität mit Hilfe der Comparative-Molecular-Field-Analyse (CoMFA) erstellt. Dieses CoMFA-Modell ermöglicht ausgehend von der Struktur einer Domänen die Vorhersage der Affinität gegenüber tyrosinhaltigen Liganden. Auf der Basis der modellierten Strukturen für WW-Domänen/xPPxY-Liganden- Komplexen wurde mit Hilfe der Comparative-Binding-Energy-Analyse (COMBINE) ein verbessertes quantitatives Struktur-Aktivitäts-Modell der Tyrosin-Spezifität erstellt. Die explizite Repräsentation des Liganden in diesem COMBINE-Modell ermöglichte insbesondere das Design eines Liganden mit erhöhter Affinität gegenüber der ersten WW-Domäne der NEDD4-ähnlichen Ubiquitin-Ligase yRSP5 aus Hefe. Für die Threonin-zu-Aspartat-Mutation in Position -5 relativ zum Tyrosin in dem Peptid GT-5PPPPYTVG wurde eine beinahe dreifach gesteigerte Affinität vorhergesagt. Diese signifikante Steigerung wurde anschließend experimentell bestätigt. Interessanterweise befindet sich innerhalb des Erkennungsmotivs in dem für yRSP5 bekannten Wechselwirkungspartner YM95_YEAST ebenfalls ein Aspartat in dieser Position, was die in vivo Relevanz der Vorhersage unterstreicht. Schließlich wurde die Methode der Quantitativen Spezifitäts-Profile (QSP) entwickelt, die es erstmals erlaubt, die Spezifität einer Protein- Interaktionsdomäne in Form einer Ligandensequenz-abhängigen Affinitätsfunktion über den gesamten Liganden-Sequenzraum zu quantifizieren. Damit kann nicht nur die Spezifität in einer intuitiven Form (Termschema) visualisiert werden, sondern die QSP-Modelle ermöglichen vor allem die Vorhersage der Affinitäten für alle potentiellen peptidischen Liganden. Exemplarisch wurden QSP-Modelle für die drei PDZ-Domänen aus hAF6, hERBIN und mSNA1 erstellt (http://www.fmp- berlin.de/nmr/pdz). Mit ihrer Hilfe wurden die bislang unbekannten optimalen peptidischen Liganden (Superbinder) für jede der drei PDZ-Domänen vorhergesagt. Auch diese konnten anschließend experimentell bestätigt werden. Darüber hinaus ermöglichen QSP-Modelle auch die Quantifizierung der Selektivität konkurrierender Domänen. Für die drei PDZ-Domänen konnten dadurch sowohl signifikante Unterschiede in der Selektivität als auch eine unerwartet große Überlappung der Liganden-Sequenzräume festgestellt werden.

Almost all cellular processes depend on finely tuned protein-protein- interactions. A substantial number of these interactions are mediated by a relatively small number of sequentially and structurally conserved protein- interaction domains using conserved mechanisms. Some of these interactions represent also interesting targets for new pharmacological intervention strategies. In this work, qualitative and quantitative interaction models were built on the sequence and structure level to understand the mechanisms of binding as well as specificity and to predict new potential interactions for protein- interaction-domains (WW and PDZ domains). These statistical models were trained using experimental interaction data obtained by screening 42 WW domains and 3 PDZ domains with peptide libraries. For WW domains, a classification system was developed which for the first time allowed the assignment of WW domains as well as their proline-rich ligands to the following 6 different specificity groups based solely on their sequences: the Y-specificity group characterized by the xPPxY-recognition motif, the Ra- group with the (P/F/I/V)P(P/G)PPPR-motif, the Rb-group with the PPPRGPPP- motif, the L-group with the PPLPP-motif, the phosphoserin(poS)/phosphothreonine(poT)-group with the (poT/poS)P-motif and the poly-P-group with the (P/I/V/L)PPPPP-motif. As the specificity determining residues in the domains could also be identified for 5 of the 6 specificity groups, 66 % of all 482 known WW domains (SMART-database, as of 11/15/2001) could be assigned to one of the specificity groups. Subsequently, the predicted tyrosine-specificity for 3 WW domains with before unknown specificity was experimentally confirmed. For statistical interaction models based on domain or complex structures, the 3D-structures of all 42 experimentally analyzed WW domains were built by homology modeling. Furthermore, models of the domain/ligand-complex structures for each of the 6 specificity groups were devised based on systematic analyses of the recognition motifs (substitutional analyses). Thus, the first consistent hypothesis for the recognition of arginine-containing ligands by WW Domains of the Ra\- and Rb-specificity groups could be suggested. Based on the modeled structures of the 42 WW domains, a quantitative structure-activity-model of tyrosine-specificity was built using the Comparative-Molecular-Field-Analysis (CoMFA). This CoMFA-model allowed the prediction of affinity towards tyrosine-containing ligands based on the structure of the domains. Based on the modeled WW-domain/xPPxY-ligand complexes, an enhanced quantitative structure-activity-model of tyrosine-specificity was built using the Comparative-Binding-Energy-Analysis (COMBINE). The explicit representation of ligands in this COMBINE-model allowed particularly the design of a ligand with higher affinity towards the first WW domain of the yeast NEDD4-like Ubiquitin-ligase yRSP5. For the threonine-to-aspartate mutation in position -5 relative to the tyrosine of the peptide GT-5PPPPYTVG an almost 3-fold increase in affinity was predicted. This significant increase was confirmed experimentally. Interestingly, an aspartate is found in the same position within the recognition motif in the known yRSP5 interaction partner YM95_YEAST, emphasizing the in vivo relevance of this prediction. Finally, the Quantitative-Specificity-Profile (QSP) method was developed. For the first time it allows the quantification of the specificity of a protein- interaction domain in terms of a ligand sequence-dependent affinity function defined for the complete ligand sequence space. By using QSP, not only is the specificity visualized intuitively (term scheme) but the affinities are predicted for all potential ligands. QSP-models were built for the PDZ domains of hAF6, hERBIN and mSNA1 (http://www.fmp-berlin.de/nmr/pdz). They were used to predict the optimal peptidic ligands (superbinder) for each of the three domains. Subsequently, these were confirmed experimentally. In addition QSP- models also permit the quantification of selectivity for competing domains. For the three PDZ domains, significant differences in selectivity as well as a surprisingly large overlap of the ligand sequence spaces were found.