Development and application of molecular diagnostic assays in the epidemiology of cutaneous leishmaniasis in the Jenin District

Abstract

In Palestine, cutaneous leishmaniasis (CL) is mainly caused by Leishmania major and L. tropica. From 2002 and 2009, 466 CL cases were reported in Jenin District (JD) with an average annual incidence of 23 cases per 100,000 inhabitants. Most cases presented a single lesion, generally on the face. Diagnosis and species identification in clinical materials were done by applying PCR assays. In this study, a new approach was developed targeting the 7SL RNA gene. The causative species was identified by RFLP analysis of the 7SL product and by reverse dot blot (RDB) hybridization using five probes. One probe was a genus-specific probe and hybridized to all leishmanial species (Lc), two were specific for L. major (Lm1 and Lm2), one was specific for L. tropica (Lt) and one detected both L. major and L. tropica (Lmt). The PCR–RDB was 10 times more sensitive than 7SL PCR-RFLP and could detect <1 parasite. The 7SL PCR was compared to widely used PCR approaches targeting kinetoplast DNA (kDNA) and ribosomal internal spacer sequences (ITS1), for its ability to detect parasites in skin tissue aspirates of 212 CL suspects. The kDNA PCR was most sensitive, detecting 156/170 of the truly-positive samples but failed in identifying the species of Leishmania. The 7SL PCR detected 154/170 and the ITS1 PCR only 108/170 of the truly-positive ones. Species identification was possible with either the 7SL or ITS1 PCR assays. L. tropica was the predominant cause of CL when species identification had been performed using DNA isolated from parasite cultures (47) or skin tissue scrapings (256), followed by L. major. For the first time, L. infantum was identified as the causative agent of CL in four Palestinian patients. Considerable intra-species genetic heterogeneity was observed when 12 strains of L. tropica from JD were analyzed by different analytical methods. Three of them constituted a new zymodeme, zymodeme MON-307, which seems to be unique to the northern part of the Palestinian West Bank. Other strains belonged to the known zymodeme MON-137. Excreted factor (EF) serotyping showed that MON-307 strains were sub- serotype A2 and those of MON-137 were either A9 or A9B4. The sub-serotype B4 component appears to be unique to some strains of L. tropica of zymodeme MON-137. When their kDNA was digested with the endonucleases RsaI and MboI, Palestinian strains were assigned to different genetic groups, in congruence to their geographical origin, and different zymodeme and EF types.

In Palästina werden kutane Leishmaniosen (CL) hauptsächlich durch Leishmania major und L. tropica verursacht. Zwischen 2002 und 2009 wurden insgesamt 466 humane CL-Fälle im JD registriert, die durchschnittliche jährliche Inzidenz betrug 23 Fälle pro 100000 Einwohner. Die meisten Erkrankten wiesen nur eine Hautläsion, meistens im Gesicht, auf. Die Diagnose und Speziesidentifizierung in klinischen Materialien wurden mit verschiedenen PCR-Verfahren durchgeführt. In dieser Arbeit wurde ein neues PCR-Verfahren entwickelt, welches das 7SL RNA-Gen amplifiziert und bei dem die unterschiedlichen Erreger entweder durch RFLP-Analysen der amplifizierten Produkte oder durch „reverse dot blot (RDB)“- Hybridisierung mit fünf spezifischen Sonden identifizert wurden. Eine Sonde war genus-spezifisch (Lc) und hybridisierte an die Sequenzen aller Leishmania- Arten, zwei Sonden waren spezifisch für L. major (Lm1 und Lm2), eine für L. tropica (Lt) und eine Sonde (Lmt) detektierte sowohl L. major als auch L. tropica. Diese PCR-RDB-Methode war zehnfach empfindlicher als die 7SL PCR-RFLP und konnte <1 Parasiten nachweisen. Die 7SL-PCR wurde mit häufig angewendeten PCR-Verfahren, die die Kinetoplasten-DNA (kDNA) oder den ribosomalen internalen Spacer (ITS1) amplifizieren, hinsichtlich ihrer Fähigkeit verglichen, Parasiten in Hautproben von 212 Personen mit Verdacht auf CL nachzuweisen. Die höchste Sensitivität wurde mit der kDNA PCR erreicht, die 156 der 170 „echt“ positiven Proben detektierte, aber keine Speziesidentifizierung ermöglichte. Mit der 7SL PCR und der ITS1 PCR wurden Leishmania-Sequenzen in 154 bzw. nur 108 der 170 „echt“ positiven Proben amplifiziert, beide Methoden konnten aber für die Identifizierung der unterschiedlichen Spezies genutzt werden. L. tropica war der häufigste Erreger von CL, wenn eine Speziesidentifizierung in DNA-Proben durchgeführt wurde, die aus Leishmania-Kulturen (47) oder direkt aus Hautproben (256) isoliert worden waren, gefolgt von L. major. Erstmalig wurde L. infantum als Erreger von CL bei 4 palästinensischen Patienten bestätigt. Eine ausgeprägte intra- spezifische Heterogenität wurde für 12 L. tropica-Isolate aus JD mit verschiedenen analytischen Verfahren nachgewiesen. Für drei dieser Stämme wurde ein neues Zymodem, MON-307, beschrieben, das bisher nur im Norden der palästinensischen Westbank gefunden wird. Andere Stämme entsprachen dem bereits bekannten Zymodem MON-137. Die MON-307 Stämme wurden in der „excreted factor“ (EF) Serotypisierung dem Sub-Serotyp A2 zugeordnet und die des Zymodems MON-137 entweder A9 oder A9B4. Die Komponente B4 wurde bisher nur bei einigen L. tropica-Stämmen des Zymodems MON-137 nachgewiesen. Wenn die kDNA mit den Restriktionsendonukleasen RsaI und MboI verdaut wurde, konnten die palästinensischen Stämme verschiedenen genetischen Gruppen zugeordnet werden, in Übereinstimmung mit ihrer geographischen Herkunft und ihren Zymodem- und EF-Typen.