Die Rolle von ortho-Vanillin in der Therapie des Glioblastoma multiforme

Abstract

The treatment of glioblastoma multiforme (glioblastoma), the most common primary malignant brain tumour, is not satisfying despite multimodal approaches since they only lead to a median survival of 15 months. One of the tumour-supporting mechanisms is the toll-like receptor 2 (TLR-2) signaling pathway which leads to the expression of Matrix metalloproteases and enables the tumour to invade the tissue. The TLR-2 is expressed both by the protumourgenic immune cells –tumour-associated microglia - and by the tumour cells themselves. A possible antagonization of this signaling pathway by ortho-vanillin (O-vanillin), known from the food industry, has recently been discussed, due to the ability of this substance to cross the blood-brain barrier.

In this work both the TLR-2-dependent and the TLR-2-independent influence of O-vanillin on the glioma was examined in order to identify the potential therapeutic approaches. With the help of Alamar Blue and Trypan Blue vitality assays, the optimal O-vanillin concentration of 100µM was determined, which affects both the murine GL261 and the human U87 glioma cells without damaging the normal microglia. In the ex vivo organotypic brain slice culture the reducing influence of O-vanillin on the tumoursize could be proven, which is presumably due to the inhibition of proliferation of the tumour cells. This effect is not exclusively dependent on TAMs, since the decrease in tumour growth could also be observed after depletion of microglia and subsequent o-vanillin treatment. In addition, the o-vanillin showed a reducing effect on the migration of the tumour cells in the Boyden chamber assay. The promigratory effect of both TLR-2 agonists and ATP was inhibited by O-vanillin, which suggests the involvement of TLR-2-independent mechanisms. Ultimately, the addition of a knownTLR-2-signaling pathway antagonist - minocycline decreased the reducing effect of O-vanillin on the tumour metabolism in the Alamar Blue vitality experiment, which implies a possible competitive effect of these two substances on the TLR-2.

The O-vanillin reduces tumour growth and migration of the microglia in the murine in vitro and ex vivo model via the TLR-2 signaling pathway and in TLR-2-independent manner. Further research on the influence of O-vanillin on human glioblastoma cells in ex vivo experiments and the pharmacokinetics of the substance should be carried out before starting the in vivo experiments in order to evaluate the potential therapeutic benefit in treating glioblastoma multiforme in human.

Die Therapiemöglichkeiten vom Glioblastoma multiforme (Glioblastom), dem häufigsten malignen hirneigenen Tumor, sind trotz multimodaler Ansätze nicht zufriedenstellend, da sie lediglich zu einem Medianüberleben von 15 Monaten führen. Eins der tumorunterstützenden Mechanismen ist der Toll-Like-Rezeptor-2-Signalpfad (TLR-2), der die Expression von Matrix-Metalloproteasen bedingt und die Invasion des Tumors im Gewebe ermöglicht. Der TLR-2 wird sowohl von den tumorunterstützenden Immunzellen - Tumor-Assoziierten-Mikroglia (TAM)- als auch von den Tumorzellen selbst exprimiert. Eine mögliche Antagonisierung dieses Signalweges durch das ortho-Vanillin (o-Vanillin), bekannt aus der Lebensmittelindustrie, wurde neulich diskutiert, angesichts der Fähigkeit dieser Substanz, die Blut-Hirn-Schranke zu passieren. In dieser Arbeit wurden sowohl der TLR-2- anhängige als auch TLR-2-unabhängige Einfluss von o-Vanillin auf das Glioblastom untersucht, um die potenziellen therapeutischen Ansätze zu identifizieren. Mithilfe von Alamar Blue und Trypan Blue Vitalitätsexperimenten konnte die optimale o-Vanillin Konzentration von 100μM ermittelt werden, die sowohl die murinen GL261- als auch die humanen U87-Glioblastom-Zellen beeinträchtigt, ohne die gesunden Mikroglia zu schädigen. In ex vivo organotypischen Hirnschnitten konnte der reduzierende Einfluss von o-Vanillin auf die Tumorgröße bewiesen werden, der vermutlich auf die Proliferationshemmung der Tumorzellen zurückzuführen ist. Dieser Effekt ist nicht ausschließlich TAM-abhängig, da nach der Depletion von Mikroglia und anschließender o-Vanillin-Behandlung die Abnahme des Tumorwachstums beobachtet werden konnte. Zudem zeigte das-Vanillin in dem Boyden-Kammer-Experiment einen reduzierenden Effekt auf die Migration der Tumorzellen. Der promigratorische Effekt von sowohl TLR-2-Agonisten als auch ATP wurde durch o-Vanillin gehemmt, was die Involvierung von TLR-2-unabhängigen Mechanismen vermuten lässt. Letztendlich schwächte die Zugabe von dem bekannten TLR-2-Singlaweg-Antagonisten – Minocyclin - den reduzierenden Effekt von o-Vanillin auf den Tumorstoffwechsel im Alamar Blue-Vitalitätsexperiment ab, was eine mögliche kompetitive Wirkung dieser beiden Substanzen an dem TLR-2 impliziert. Das o-Vanillin reduziert das Tumorwachstum und die Migration der Mikroglia im murinen in vitro und ex vivo Modell sowohl über den TLR-2-Signalweg als auch TLR-2-unabhängig. Die weitere Erforschung des Einflusses von o-Vanillin auf die humanen Glioblastoma -Zellen in ex vivo Experimenten sowie die Pharmakokinetik der Substanz sollte vor in vivo Experimenten in Mäusen erfolgen, um den potenziellen therapeutischen Nutzen bei der Behandlung des Glioblastoma multiforme in Menschen zu evaluieren.