Human neutrophils kill B. anthracis via an α-defensin dependent mechanism

Abstract

The environmentally highly resistant B. anthracis spores cause natural infections in man and animals but have also been used as biological weapons. B. anthracis infection begins through intradermal inoculation, ingestion or inhalation of spores. Human pulmonary and gastric infections with Bacillus anthracis are almost always lethal, yet cutaneous infections usually remain localized and resolve spontaneously. Interestingly neutrophils are recruited to cutaneous but not other forms of B. anthracis infections, raising the possibility that neutrophils kill B. anthracis. Neutrophils are the first cells of the innate immune system, which are recruited to a site of infection. Other cells of the innate immune system such as macrophages and dendritic cells have been implicated in the dissemination of B. anthracis and in the pathology of the infection, but not in its resolution. The role neutrophils play in B. anthracis infection has not been extensively studied. B. anthracis is characterized by its two virulence plasmids encoding the two major virulence factors: the tripartite anthrax toxin and the poly-D-glutamate capsule. The toxin induces oedema and shock-like symptoms; the capsule was reported to have antiphagocytic properties. In this study we infected human neutrophils with B. anthracis spores or vegetative bacteria expressing either of the two major virulence factors. As studied by electron microscopy, human neutrophils engulfed B. anthracis spores, which germinated intracellularly and were then killed. The killing of vegetative bacteria either expressing the toxin or the capsule was also examined. Both B. anthracis strains were phagocytosed and efficiently killed. Through inhibition of neutrophil phagocytosis with cytochalsin D we showed that the killing mechanism was of both intracellular and extracellular nature. Further, the killing of the vegetative cells was not due to reactive oxygen species but a result of the activity of a human neutrophil granule extract. This was elucidated by the use of an inhibitor of ROS production. We fractionated the neutrophil granule extract (hNGE) by high performance liquid chromatography with a combination of C4/ C4/ C18 reverse phase columns. -defensins were identified by MALDI TOF TOF analysis as the component responsible for B. anthracis killing. -defensins are constituents of the neutrophil azurophil granules, which have also been implicated in the neutralization of the anthrax toxin. These data show that human neutrophils induce germination of B. anthracis spores and consequently kill the vegetative cells. This and the pathohistology of human anthrax cases suggest that the timely recruitment of neutrophils in the human cutaneous form of the disease can control B. anthracis infections. This is supported by the fact that pulmonary infections in pigs and dogs show massive neutrophil infiltration, resulting in survival of the host.

B. anthracis infiziert seinen Wirt durch intradermale sowie orale Aufnahme oder durch Inhalation von Sporen. Humane pulmonale und gastrointestinale Verlaufsformen weisen eine sehr hohe Mortalität auf. Im Gegensatz dazu ruft die dermale Form lokale Hautveränderungen hervor und heilt in 90% aller Fälle spontan. Interessanterweise werden bei der dermalen Form neutrophile Granulozyten an den Infektionsherd rekrutiert, während diese Infiltration in den zwei anderen klinischen Formen selten beschrieben wird. Dies eröffnet die Frage ob neutrophile Granulozyten B. anthracis töten und dadurch eine ungeahnte und drastische Auswirkung auf das Krankheitsgeschehen haben können. Während dieser Studie wurden neutrophile Granulozyten mit entweder B. anthracis Sporen oder vegetativen Bakterien infiziert, die einen der beiden Hauptvirulenzfaktoren exprimieren. Die humanen neutrophilen Granulozyten phagozytieren die B. anthracis Sporen, diese germinieren intrazellulär und werden von den neutrophilen Granulozyten getötet. Die Interaktion neutrophiler Granulozyten mit toxin- oder kapselproduzierenden vegetativen Bakterien wurde auch untersucht. Beide Stämme werden phagozytiert und effizient getötet. Der Tötungsmechanismus ist unabhängig von reaktiven Sauerstoffspezies, aber abhängig von einem aus humanen neutrophilen Granulozyten gewonnenem Granulaextrakt. Das Extrakt wurde mit High Performance Liquid Chromatography (HPLC) fraktioniert und α-Defensine als eine der zuständigen anti-B. anthracis Komponenten identifiziert. Unsere Daten, im Zusammenhang mit der Pathohistologie humaner Milzbrandfälle, implizieren, dass die rechtzeitige Einwanderung neutrophiler Granulozyten während des kutanen Milzbrand zur lokalen Eindämmung dieser Infektion führt. Diese These wird durch den Umstand unterstützt, dass die pulmonale Form bei Hunden und Schweinen mit massiver neutrophiler Granulozyteninfiltration einhergeht, welches zum Überleben dieser Wirte führt.