Mechanistic insights into ALK inhibitor resistance in neuroblastoma

Abstract

Anaplastic lymphoma kinase (ALK) is a driving oncogene in neuroblastoma and mutated in 8% - 10% of neuroblastoma cases. Despite high-risk neuroblastoma patients being treated with an intensive multimodal therapy, up to 60% of these patients relapse and the 10-year overall survival rate for high-risk cases is less than 40%. Therefore, targeted therapies are under investigation for paediatric use and might be considered as first-line therapy. Many cases of acquired therapy resistance to targeted therapies have been reported, including cases during paediatric clinical trials of ALK inhibitors. Hence a deeper understanding of resistance development is required and investigated within this thesis. The first part of this thesis focused on the identification of genes associated with ALK inhibitor (ALKi) resistance using in vitro neuroblastoma systems. A CRISPR/Cas9 knockout screen in the ALK-mutated neuroblastoma cell line SH-SY5Y identified the tumour suppressor gene NF1 to be associated with resistance to the ALK inhibitors ceritinib and lorlatinib. The hypothesis, whether a loss of NF1 can confer ALKi resistance in ALK-mutated neuroblastoma was investigated by generating isogenic NF1 knockout (KO) models using the CRISPR/Cas9 system in respective neuroblastoma cell lines. It was observed, that an NF1 KO leads to an ALKi-resistant phenotype as well as increased RAS/MAPK pathway signalling.

Moreover, gene alterations were also investigated in tumour and liquid biopsy samples of patients with relapsed, ALK-driven neuroblastoma, who have been treated with ALK inhibitors in paediatric clinical trials. These patients had initially responded well to the treatment but eventually relapsed and de novo inactivating mutations of NF1 were detected in these relapse tumour samples using sequencing approaches. Thus, genes which were found associated with ALKi resistance in neuroblastoma cell lines were also observed in relapse samples of patients with ALK-driven neuroblastoma treated with ALK inhibitors.

The second part of this thesis focused on the role of NF1 loss in ALKi resistance, its effect on ALK downstream signalling and new collateral sensitivities. This role was investigated by perturbation experiments and subsequent ELISA assays to quantify protein phosphorylation, and thus pathway activity. NF1 knockout cell line models showed increased downstream signalling of the RAS/MAPK pathway. The perturbation data was used with a prior known signalling network topology to model the downstream signalling response in NF1-deficient neuroblastoma cells. The model indicated an absent ERK-RAF feedback loop and implied a possible MEK inhibitor sensitivity. When NF1-deficient neuroblastoma cells were exposed to the MEK or RAF inhibitors, increased inhibitor sensitivities were observed.

Overall, this thesis employed phenotypic screens as well as isogenic cell lines as suitable models to investigate and elucidate clinical observations. Hence, it was successful in demonstrating an association of genetic NF1 alterations with ALKi resistance in cell line models, in the same manner as in a functional experimental recapitulation of observed NF1 alterations in clinical cases of ALKi resistant ALK-driven neuroblastoma. This thesis underlined how modelling of signalling pathways can be used to reveal new collateral sensitivities and gives some mechanistic insights as well as new potential therapy options, which may potentially impact clinical practice and clinical trial design. The identified collateral sensitivities represent promising therapy options for patients with relapsed ALK-mutated and ALK-inhibitor resistant neuroblastoma harbouring loss of NF1 mutations, which are worth being investigated in clinical trials, that cover sequential treatment as well as a pre-emptive combination therapy with ALK and MEK inhibitors.

Das ALK (anaplastische Lymphomkinase) Gen ist ein bekanntes Onkogen des Neuroblastoms, welches in 8 %-10 % der Patienten/innen mit einer Neuroblastomerkrankung Mutationen aufweist. Trotz einer intensiven und multimodalen Therapie von Patienten/innen mit einem Hochrisiko-Neuroblastom kommt es in bis zu 60 % der Fälle zu einem Rezidiv, was mit einem 10-Jahres-Gesamtüberleben von weniger als 40 % einhergeht. Zielgerichtete Therapien sind daher in den Fokus von pädiatrisch-klinischen Studien gerückt und könnten ebenfalls für eine Erstlinienbehandlung in Betracht gezogen werden. Es wurden bereits einige Fälle von Resistenzentwicklung gegenüber zielgerichteten Therapien beschrieben, einschließlich Fälle aus pädiatrisch-klinischen Studien für ALK-Inhibitoren. Die Identifizierung der grundlegenden Mechanismen dieser Resistenzentwicklung sind daher unerlässlich und waren zentraler Gegenstand der vorliegenden Arbeit. Der erste Teil dieser Doktorarbeit befasste sich mit der Identifizierung von ALK-Inhibitor vermittelnden Resistenzgenen in in vitro Zellmodellen des Neuroblastoms. Mit Hilfe einer genomweiten sgRNA Bibliothek und dem CRISPR/Cas9 Systems wurden Gene in der ALK-getriebenen Neuroblastomzelllinie SH-SY5Y ausgeschaltet und das Tumorsuppressorgen NF1 mit einer Resistenz gegenüber den ALK Inhibitoren Ceritinib und Lorlatinib assoziiert. Die abgeleitete Hypothese, dass inaktivierende Mutationen des NF1 Gens eine ALK-Inhibitor Resistenz bedingen, wurde durch Generierung von isogenen ALK-mutierten Neuroblastomzelllinien mit einem CRISPR/Cas9-vermitteltem Ausschalten von NF1 untersucht. Es wurde beobachtet, dass das Ausschalten von NF1 in diesen Zelllinien zu einem ALK-Inhibitor-resistenten Phänotypen führt und dass diese Zellen eine erhöhte Aktivität der RAS/MAPK Signaltransduktionskaskade aufweisen. Des Weiteren wurden Tumorgewebsproben von Patienten/innen mit einem rezidivierten ALK-getriebenen Neuroblastom untersucht, welche in klinischen Studien zur ALK-Inhibitor Therapie behandelt wurden. Zunächst ließ sich unter Therapie eine Tumorregression beobachten, doch im weiteren Therapieverlauf kam es zur erneuten Tumorprogression. In diesen Rezidiv-Proben wurden de novo Mutationen detektiert, die zu einem Verlust von NF1 führten. Somit ließen sich in vitro identifizierte ALK-Inhibitor Resistenzgene auch in Patientenproben beobachten. Der zweite Teil dieser Doktorarbeit fokussierte sich auf die Rolle eines NF1-Verlusts während einer ALK-inhibitor Resistenz, die durch einen NF1-Verlust bedingten Veränderungen der ALK-aktivierten Signaltransduktionskaskaden sowie neue begleitende Sensitivitäten. Dazu wurden Perturbationsexperimente durchgeführt und phosphorylierte Proteine mithilfe von ELISA Experimenten quantifiziert. Diese Quantifizierung ließ Rückschlüsse auf die jeweilige Aktivität der ALK-aktivierten Signaltransduktionskaskaden zu. Zelllinienmodelle mit inaktiviertem NF1 zeigten dabei eine gesteigerte Aktivität der RAS/MAPK- Signaltransduktionskaskade.

Die Ergebnisse der Perturbationsexperimente wurden zusammen mit einer literatur-basierten Struktur der Signaltransduktionskaskaden genutzt, um mithilfe eines systembiologischen Ansatzes Aktivitäten der ALK-aktivierten Signaltransduktionskaskaden zu modellieren. Anhand des Modells entstand die Annahme, dass Zelllinienmodelle mit inaktiviertem NF1 keine negative ERK-RAF-Rückkopplung aufweisen, was mit einer einhergehenden Sensitivität für MEK-Inhibitoren beschrieben wurde. Als Neuroblastomzelllinien mit fehlerhaftem NF1 gegenüber MEK und RAF Inhibitoren getestet wurden, konnte eine höhere Sensitivität für diese Inhibitoren beobachtet werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde demonstriert, dass phänotypische Screens sowie isogene Zelllinienmodelle geeignete Modelsysteme sind, um klinisch getriebene Hypothesen experimentell zu untersuchen. Daher konnte erfolgreich ein Zusammenhang zwischen inaktivierenden NF1 Mutationen und einer ALK-Inhibitor Resistenz in ALK-getriebenen Neuroblastomzelllinien aufgezeigt werden, welcher ebenfalls in ALK-mutierten, ALK-Inhibitor resistenten Neuroblastomen beobachtet wurde. Die vorliegende Arbeit verdeutlicht, wie systembiologische Ansätze genutzt werden können, um neue Inhibitorsensitivitäten und Resistenzmechanismen zu identifizieren. Damit einhergehende neue Therapieansätze für die Behandlung von Patienten/innen mit einer Neuroblastomerkrankung könnten den klinischen Alltag sowie das Aufsetzen klinischer Studien beeinflussen. Diese neuen Inhibitorsensitivitäten stellen vielversprechende Therapieansätze für Patienten/innen mit einer rezidivierten ALK-mutierten und ALK-Inhibitor resistenten Neuroblastomerkrankung dar, die mit einem Verlust von NF1 einhergeht, und sollte in klinischen Studien als sequenzielle Therapie oder als präventive Kombinationstherapie aus ALK- und MEK-Inhibitoren getestet werden.