HIV-1 basierter Gentransfer in die Lunge zur Behandlung von Surfactant Protein B Mangel

Abstract

Surfactant Protein B Mangel ist ein angeborener Gendefekt, der dazu führt, dass der Surfactant der Lunge die Oberflächenspannung in den Alveolen nicht ausreichend herabsetzen kann. Infolgedessen kann die Lunge bei Neugeborenen mit dieser Mutation nicht arbeiten. Es kommt zu Atemversagen und die einzige derzeitig verfügbare Therapie ist eine Lungentransplantation. In dieser Arbeit sollte überprüft werden, ob sich lentivirale Vektoren für eine Gentherapie von Alveolaren Epithelzellen des Typs II (ATII) zur Behandlung von Surfactant Protein B Mangel einsetzen lassen. Eine vorhergehende Veröffentlichung hatte gezeigt, dass VSV-G pseudotypisierte LVV Alveolarepithel und alveolare Makrophagen bevorzugt infizieren. Um LVV für solche Studien herstellen zu können, wurde eine umfangreiche Produktionsoptimierung durchgeführt, an deren Ende Titer im Bereich von 2 c 108 IP/mL erreicht wurden. Die Besonderheiten der Optimierung lagen zum Einen in der Verwendung von PDL beschichteten Zellkulturplatten. Durch dieses Vorgehen konnten problemlos 7,5 c 106 Zellen in einer 10 cm Schale ausgesät werden, so dass am Tag der Transfektion mit lPEI eine 100% Konfluenz der Zellen vorlag. Die andere Besonderheit war die Verwendung einer Ultrafiltration anstelle einer Ultrazentrifugation zur Reinigung und Konzentrierung der lentiviralen Partikel. Im Anschluss wurde ein geeigneter interner Promotor für den Transfervektor gesucht. Diese Promotoren wurden verglichen: humaner Elongationsfaktor 1 a, Ubiquitin B & C, Cytomegalovirus und Surfactant Protein B. Die Wahl fiel auf den EF1a Promotor, da er eine stabile Langzeitexpression über 150 Tage in vitro und eine gute Produzierbarkeit aufwies. Diese stabile Langzeitexpression eines Luciferase- Reportergens konnte auch in vivo auf Lebenszeit der Mäuse nachgewiesen werden. Dafür wurden 10.000 IP intranasal instilliert, ohne eine sonst übliche Vorbehandlung durch bspw. Lysophosphatidylcholin. Eine in vitro Überprüfung des Transfervektors mit dem therapeutischen SP-B Gen ergab in HEK293T, A549 und MLE12 Zellen die Sekretion einer SP-B Vorstufe. Die in vivo Überprüfung dieses LVV war nicht erfolgreich. Selbst konditionale SP-B Knock out Mäuse, die eine dreimalige Dosis erhalten hatten, waren nicht überlebensfähig. Zur Überprüfung wurde ein Transfervektor mit LacZ Reportergen kloniert und wie der SP-B enthaltende LVV appliziert. Die Begutachtung durch einen Pathologen ergab zwar die erfolgreiche Transduktion der Zielzellen, wie auch schon in den in vivo Versuchen. Allerdings war die Transduktionseffizienz im alveolaren Deckepithel so gering, dass kein positiver Effekt in Erscheinung trat. Grund dafür war eine umfangreiche Transduktion des Bronchialepithels, so dass nicht mehr ausreichend Vektoren in die Alveolarregionen vordringen konnten. Für eine erfolgreiche SP-B Gentherapie muss die Applikationsroute entscheidend verbessert werden – was z.B. durch eine bronchoalveoläre Lavage oder eine Aerosolapplikation geschehen könnte.

Surfactant Protein B deficiency is an inherited genetic disorder, causing the malfunction of pulmonary surfactant. The lung of newborn with this disorders cannot work correctly, leading to respiratory distress which can only be treated by a lung transplantation in the moment. Therefore, this work deals with the possible use of lentiviral vectors as a gene therapy vehicle to Alveolar Type II cells in order to treat SP-B deficiency. A previous publication showed that VSV-G pseudotyped LVV are predominantly transducing alveolar epithelium and macrophages. To be able to produce suitable amounts of LVV for doing these studies, an extensive production optimization took place, with final titers around 2 c 108 IP/mL. Special in the chosen production process were on the one hand the usage of PDL coated cell culture surfaces, which allowed a very good handling and high transfection efficiencies. On the other hand, it was special to replace the usual ultracentrifugation by an ultrafiltration for purification and concentration of the vector containing supernatants. Subsequently, a suitable internal promoter for the transfer vector was determined. The following elements were compared: human Elongation Factor 1 a, Ubiquitin B & C, Cytomegalovirus and Surfactant Protein B. The favored promoter was EF1a, due to its stable long term expression over 150 days in vitro and its good producibility. The stable long term expression of a Luciferase reporter gene could also be observed in vivo, for the whole life time of the mice. This life time expression is very promising, because it was achieved with only 10.000 IP, which were instilled nasally, without any pretreatment with i.e. Lysophosphatidylcholin. An in vitro testing of the transfer vector containing the therapeutic SP-B Gene showed a successful secretion of a SP-B preproprotein in HEK293T, A549 and MLE12 cells. But nethertheless, an in vivo study was not successful. Even conditional SP-B knock out mice, which received three doses of 1 c 108 IP on average, were not able to survive. As a control a transfer vector with a LacZ reporter gene was cloned and applied according to the protocol used for the SP-B in vivo study. The expert opinion of a pathologist made clear that there was successful transduction of the target cells, but on a far too low level. This was most possibly due to the extensive transduction of bronchial epithelium, sparing not enough vector to reach high transduction in alveolar region. According to this result VSV-G pseudotype is – at least in the used mouse model – not predominantly targeting alveolar cells. For a successful SP-B gene therapy it is vital to improve the application route. Possible would be i.e. a bronchoalveolar lavage or an application as an aerosol.