Influence of L-carnitine on transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) activity in human corneal keratocytes

Abstract

Background/Aims: Transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) belongs to the vanilloid TRP channel family and was first known as a pain receptor which can be activated by capsaicin (CAP), the pungent ingredient in hot chili peppers. Since TRPV1 is expressed in corneal tissues including corneal nerve fibers, there is substantive evidence that functional TRPV1 expression has important roles in controlling corneal transparency, which is required for normal vision. On the one hand, this channel is involved in wound healing processes by promoting stromal fibroblast transdifferentiation into myofibroblasts. On the other hand, TRPV1 activation can lead to calcium influx and the release of proinflammatory cytokines triggering inflammatory ocular surface diseases. Due to these novel roles of TRPV1, its characterization in each corneal cell layer is essential to elucidate the promoting or inhibiting influence of endogenous modulators on this channel activity. This insight may help to identify novel procedures for improving therapeutic management of wound healing. Previous studies suggested that L-carnitine has osmoprotective effects in human corneal and conjunctival epithelial cells, elicited through the suppression of hypertonic-induced TRPV1 activation. In this thesis, the inhibitory influence of L-carnitine on TRPV1 activity in immortalized human corneal keratocytes (HCK) was investigated. Methods: The planar patch-clamp technique was used to record whole-cell currents of TRPV1 in an established HCK cell line. In addition, the intracellular calcium concentration ([Ca2+]i) was measured using fluorescence calcium imaging, whereby the fluorescence ratio (f340nm/f380nm) is proportional to [Ca2+]i. The effect of L-carnitine was investigated on heat-, hypertonic-, and CAP-induced TRPV1 activation. Results: 1 mM L-carnitine inhibited increases of [Ca2+]i induced by either hypertonic stress (450 mOsM), temperature rise (≈ 43 °C) or extracellular application of 10 μM CAP. In parallel with the calcium regulation, L-carnitine also suppressed the underlying increases in ionic currents induced by TRPV1 activation. Conclusion: There is functional TRPV1 expression in HCK. Furthermore, an inhibiting effect of L-carnitine on TRPV1 activity was evidenced in HCK for the first time. In a clinical context, these findings suggest a protective effect of L-carnitine against TRPV1-induced [Ca2+]i increases and hold promise for reducing stromal scarring through corneal wound healing.

Hintergrund/Zielsetzung: Der Transient Rezeptor Potential Vanilloid 1 (TRPV1) ist der bekannteste Vertreter der TRP-Kanal Familie und kann durch Capsaicin aktiviert werden (Capsaicin-Rezeptor). In vitro Studien haben zeigen können, dass der TRPV1 nicht nur im peripheren und zentralen Nervensystem, sondern auch in nichtneuronalen Zellen der Augenoberfläche vorkommt. Durch seine Expression im Hornhautgewebe übernimmt er eine wichtige Rolle in der Aufrechterhaltung der Hornhauttransparenz, welche für einen klaren Seheindruck entscheidend ist. Einerseits ist der TRPV1 in Prozessen der stromalen Wundheilung involviert. Andererseits erhöht seine Aktivierung den Calciumeinstrom sowie die Freisetzung proinflammatorischer Zytokine, welche zu entzündlichen Reaktionen der Augenoberfläche führen. In Hinblick auf mögliche Therapieansätze ist eine nähere Charakterisierung dieser nicht-klassischen TRPV1 Funktion in den einzelnen Hornhautschichten des Auges entscheidend. Bisherige Studien haben zeigen können, dass L-Carnitin durch seinen hemmenden Einfluss auf den TRPV1 einen osmoprotektiven Effekt sowohl im Hornhaut- als auch Bindehautepithel aufweist. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem Effekt von L-Carnitin auf den TRPV1 induzierten Calciumanstieg in humanen Hornhautkeratozyten (HCK). Methoden: Eine etablierte SV40-transfizierte HCK Zelllinie wurde als HCK Modell verwendet. Mit der planaren Patch-Clamp-Technik wurden Ganzzellströme nach TRPV1 Aktivierung in Ab- und Anwesenheit von L-Carnitin gemessen. Ferner wurden Fluoreszenzsignale (f340nm/f380nm), welche proportional zur intrazellulären Calciumkonzentration sind, mittels Fluoreszenz Calcium Imaging Verfahren aufgezeichnet. Hierbei wurde der Einfluss von L-Carnitin auf den durch Hitze (≈ 43 °C), Hyperosmolarität (450 mOsM) und Capsaicin (10 μM) aktivierten TRPV1 untersucht. Ergebnisse: 1 mM L-Carnitin reduziert die intrazelluläre Calciumkonzentration in HCK Zellen durch Hemmung des TRPV1 Kanals. Zudem konnte gezeigt werden, dass L-Carnitin die durch Capsaicin erhöhten TRPV1 Ionenströme unterdrückt. Schlussfolgerung: Funktionale TRPV1 Expression liegt auch in stromalen HCK Zellen vor. Erstmalig konnte der hemmende Einfluss von L-Carnitin auf den TRPV1 Kanal in HCK Zellen nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass L-Carnitin einen protektiven Einfluss auf durch erhöhte TRPV1 Aktivität hervorgerufene Augenschäden haben könnte. L-Carnitin könnte somit einen vielversprechenden therapeutischen Ansatz sowohl in der Vorbeugung als auch Behandlung stromaler Hornhautverletzungen darstellen.