Influence of magnesium on endocrine regulation and energy metabolism in bovine adipocytes

Abstract

High performance cattle go through a tremendous increase in energy requirements from about 3 weeks before to 3 weeks after calving. Feed intake at the onset of lactation is insufficient, leading to a negative energy balance (NEB) which is compensated for by the depletion of fat reserves in the body. Furthermore, a physiological insulin deficiency or insulin resistance or both occur in tissues such as the liver, muscle, or adipose tissue in order to supply insulinindependent tissues such as the mammary gland with sufficient glucose for lactose production. This state promotes metabolic dysfunctions with diseases like ketosis, milk fever, or inflammatory reactions like mastitis. As the main cells engaged in fat metabolism of cattle, adipocytes not only play an essential role in energy balance, but also have a whole-body influence on the health of cattle. Magnesium as the second most abundant intracellular cation plays a prominent role in the insulin signaling pathway. Magnesium homeostasis is tightly regulated with a reciprocal relationship between insulin and magnesium. The main aim of the present study was to investigate and to understand the interaction between insulin and magnesium on bovine adipocytes, with the hypothesis that magnesium could have positive effects on animal health by improving the insulin sensitivity of adipocytes. To facilitate this research, a cell culture protocol for preadipocyte differentiation into bovine adipocytes was established. Mesenchymal stem cells derived from subcutaneous adipose tissue in the neck region of calves were shown to yield large numbers of preadipocytes when cultured as explants. Cells showed the expression of stem cell markers, namely CD73, CD90, and CD105.in immunohistochemical and qRT-PCR studies. A higher expression of stem cell markers in preadipocytes was dependent on fetal bovine serum (FBS). In contrast, bovine serum lipids (BSL) increased adipocyte differentiation, with downregulation of stem cell markers and upregulation of adipocyte markers, e.g., FABP4. Thus, FBS is essential for the cultivation of mesenchymal stem cells by promoting cell replication and the expression of stem cell markers, whereas BSL counteracts this and promotes differentiation. Furthermore, it could be shown that important media additives for induction, e.g., dexamethasone, insulin, rosiglitazone, IBMX, and biotin, could be reduced to 30% of the original value derived from literature without reducing induction performance. The addition of ascorbic acid as a relevant supplement for collagen synthesis and as an antioxidant showed that, together with BSL, differentiation was most successful under these conditions. Ascorbic acid had outstanding effects on the expression of the adipocyte marker FABP4 and on LPS and the protein expression of FAS. During differentiation adipocytes increasingly formed intracellular fat vacuoles, as evidenced by Nile red staining. Because of lower density of the fat that they contained, loss of cells from the bottom of the cell culture flasks occurred. Coating of culture plates with poly-L-lysine or gelatin caused significantly better adherent cell numbers than flasks with collagen coating or without coating. To investigate the influence and interplay of magnesium and insulin on bovine adipocytes, cells were exposed to various magnesium and insulin concentrations in a two-factorial design. Lipid accumulation increased with increasing insulin concentrations, veryfying that insulin acts as an adipogenic and protective factor for adipocytes. Severe magnesium deficiency (0.1 mM) led to lower lipogenesis of cells, independently of insulin concentration. A similar pattern was seen for glucose uptake where insulin also had a promoting effect, but magnesium starvation at 0.1 mM reduced glucose uptake. Nevertheless, this effect was not as pronounced as in lipid accumulation; hence, we can assume that insulin-independent glucose uptake mechanisms are also present, for example, via the glucose transporter GLUT1, which is also influenced by magnesium. To investigate the interplay of glucose and lipid metabolism further, a glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GPDH) assay was performed. Contrary to expectations, the highest activity of GPDH was detectable in cells grown at a low physiological insulin concentration of 25 pM and in those cultured at the highest magnesium concentration of 3 mM. Considering that cattle have low insulin and glucose concentrations in the blood after calving, the present results suggest that a high supply of magnesium might promote an increased incorporation of glycerol into fat cells in vivo, thereby, decreasing the danger of fatty liver syndrome. In the last part of this work, the so-called magnesium-responsive genes were investigated by RT-qPCRs. The transporters SLC41A2, TRPM6, TRPM7, and CNNM2 showed no significant changes in their expression patterns in bovine adipocytes and thus were not affected by the concentrations of insulin or magnesium. While the expression of SLC41A1 was found to be decreased at low magnesium concentrations, presumably in order to keep the intracellular magnesium content constant. Furthermore, an inhibitory effect of insulin was shown. SLC41A3 showed a reduced expression in cells in culture medium with 250 pM insulin, similar to SLC41A1, and in low magnesium concentrations. This reduction in expression might keep mitochondrial magnesium concentration constant at low magnesium availability. The magnesium transporter MAGT1, which transports magnesium into the cell, was expressed to a greater extent at low magnesium concentrations, showing an opposite and traceable expression pattern to SLC41A1. NIPA1 also showed upregulation at low magnesium concentrations, although this effect was neutralized at high insulin concentrations. These results show that magnesium has an essential influence on insulin signalling pathways and thus fat metabolism in bovine adipocytes providing the foundation for future investigations for potential therapeutic approaches to prevent excessive lipomobilization together with possible associated diseases in cattle.

Hochleistungsrinder durchleben in der Zeit von etwa 3 Wochen vor bis 3 Wochen nach der Kalbung einen enormen Anstieg des Energiebedarfs. Die Futteraufnahme ist zu Beginn der Laktation unzureichend, was zu einer negativen Energiebilanz (NEB) führt, die kompensiert wird, indem Fettreserven des Körpers abgebaut werden. Darüber hinaus kommt es in Geweben wie der Leber, der Muskulatur oder dem Fettgewebe zu einem physiologischen Insulinmangel und/oder einer Insulinresistenz, um insulinunabhängige Gewebe, wie die Milchdrüse, mit ausreichend Glukose für die Laktoseproduktion zu versorgen. Dieser Zustand der negativen Energiebilanz kann zu Stoffwechselstörungen mit nachfolgenden Krankheiten, etwa Ketose, Milchfieber oder entzündlichen Erkrankungen wie Mastitis oder Metritis führen. Adipozyten spielen im Fettstoffwechsels bei Rindern nicht nur eine essentielle Rolle im Energiehaushalt, sondern beeinflussen multifaktoriell ganzkörperlich den Gesundheitszustand des Rindes. Magnesium, das zweithäufigste intrazelluläre Kation, spielt eine herausragende Rolle im Insulinsignalweg. Die Magnesiumhomöostase ist genauestens reguliert, wobei es ein wechselseitiges Verhältnis zwischen Insulin und Magnesium gibt. Ziel der vorliegenden Studie war es, diese Wechselwirkung auf Adipozyten von Rindern zu untersuchen und zu verstehen. Magnesium könnte sich möglicherweise positiv auf die Tiergesundheit auswirken, indem die Insulinempfindlichkeit der Fettzellen verbessert wird. Es zeigte sich, dass mesenchymale Stammzellen von Kälbern aus subkutanem Fettgewebe der Nackenregion eine große Anzahl von Präadipozyten liefern, wenn man diese als Explantatkultur kultiviert. Weiterhin exprimierten diese Zellen Stammzellmarker wie CD73, CD90 und CD105, die durch immunhistochemische und qRT-PCR-Studien ebenfalls nachgewiesen werden konnten. Eine erhöhte Expression von Stammzellmarkern in Präadipozyten war hierbei abhängig vom fötalen Kälberserum (FKS), wohingegen bovine Serumlipide (BSL) die Differenzierung der Adipozyten steigerte, sodass die Expression von Stammzellmarkern herunterreguliert wurde, wohingegen Adipozytenmarker, z.B. FABP4, vermehrt exprimiert wurden. Somit ist FBS für die Kultivierung von mesenchymalen Stammzellen unerlässlich, da es die Zellreplikation und die Expression von Stammzellmarkern fördert, während BSL dem entgegenwirkt und die Differenzierung fördert. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass wichtige Medienzusätze für die Induktion, z.B. Dexamethason, Insulin, Rosiglitazon, IBMX und Biotin, auf 30% der aus der Literatur extrahierten Werte reduziert werden konnten, ohne die Induktionsleistung zu verringern. Die Zugabe von Ascorbinsäure als relevanter Zusatz für die Kollagensynthese und als Antioxidans zeigte, dass zusammen mit BSL die Differenzierung unter diesen Bedingungen am erfolgreichsten stattfand. Ascorbinsäure hatte herausragende Effekte auf die Expression des Adipozytenmarkers FABP4 sowie auf LPS und die Proteinexpression von FAS, die ähnliche Expressionsmuster zeigten. Da die Adipozyten während der Differenzierung zunehmend intrazelluläre Fettvakuolen bilden, was anhand von Nile-red Färbungen nachgewiesen werden konnte, trieben diese aufgrund der geringeren Dichte des Fettes nach oben. Ein Verlust der Zellen vom Boden der Zellkulturflaschen war die Folge. Eine Beschichtung mit Poly-L-Lysin oder Gelatine verbesserte die Zahlen adhärenter Zellen im Vergleich mit Flaschen ohne Beschichtung oder mit einer Beschichtung aus Kollagen. Um den Einfluss und das Zusammenspiel von Magnesium und Insulin an bovinen Adipozyten zu untersuchen, wurden die Zellen in einem zweifaktoriellen Design verschiedenen Magnesium- und Insulinkonzentrationen ausgesetzt. Dabei konnte gezeigt werden, dass die intrazelluläre Lipidakkumulation mit steigenden Insulinkonzentration steigt. Starke Magnesium-Mangelbedingungen von 0,1 mM zeigten eine geringere Lipogenese der Adipozyten, unabhängig von der Insulinkonzentration. Ein ähnliches Muster zeigte sich bei der Glukoseaufnahme durch die Zellen, wo Insulin ebenfalls eine fördernde Wirkung hatte, aber ein Magnesiummangel von 0,1 mM die Glukoseaufnahme verringerte. Allerdings war dieser Effekt nicht so stark ausgeprägt wie bei der Lipidakkumulation, sodass davon auszugehen ist, dass auch insulinunabhängige Mechanismen der Glukoseaufnahme vorhanden sind, etwa der Glukosetransporter GLUT1, der ebenfalls Magnesiumabhängig ist. Um das Zusammenspiel von Glukose- und Lipidstoffwechsel weiter zu untersuchen, wurde ein Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase (GPDH)-Test durchgeführt. Entgegen den Erwartungen war die höchste Aktivität von GPDH in Zellen nachweisbar, die unter der niedrigen physiologischen Insulinkonzentration von 25 pM und der höchsten Magnesiumkonzentration von 3 mM kultiviert wurden. Berücksichtigt man, dass Rinder nach dem Kalben niedrige Insulin- und Glukosekonzentrationen im Blut haben, könnte eine hohe Magnesiumkonzentration in vivo den vermehrten Einbau von Glycerin in Fettzellen fördern und dadurch die Leber besser vor einem Fettlebersyndrom schützen. Im letzten Teil dieser Arbeit wurden die so genannten magnesium-sensitiven Gene mittels RT-qPCRs untersucht. Die Gene SLC41A2, TRPM6, TRPM7 und CNNM2 zeigten keine signifikanten Änderungen in ihren Expressionsmustern in bovinen Adipozyten und wurden somit weder von der Insulin- noch der Magnesiumkonzentrationen beeinflusst. Jedoch war die Expression von SLC41A1 bei niedrigen Magnesiumkonzentrationen verringert, vermutlich um den intrazellulären Magnesiumgehalt konstant zu halten. Des Weiteren zeigte sich ein inhibitorischer Effekt von Insulin auf dessen Expression. SLC41A3 zeigte eine Reduktion der Expression bei 250 pM Insulin und niedrigen Magnesiumkonzentrationen; möglicherweise, um die mitochondriale Magnesiumkonzentration bei geringer Verfügbarkeit konstant zu halten. Der Magnesiumtransporter MAGT1, der Magnesium in das Zellinnere transportiert, wurde bei niedrigen Magnesiumkonzentrationen stärker exprimiert und zeigte ein entgegengesetztes Expressionsmuster zu SLC41A1. NIPA1 zeigte ebenfalls eine Hochregulierung bei niedrigen Magnesiumkonzentrationen, wobei dieser Effekt bei hohen Insulinkonzentrationen neutralisiert worden ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass Magnesium einen wesentlichen Einfluss auf die Insulinsignalwege und damit auf den Fettstoffwechsel in bovinen Adipozyten hat. Dies könnte die Grundlage für zukünftige therapeutische Ansätze zur Verhinderung einer übermäßigen Lipomobilisierung und der damit einhergehenden Krankheiten bei Rindern schaffen.