Adenin-Nukleotid-Translokator 1 als Komponente des intrazellulären Signalings: Protektive Wirkung durch Modulation der interzellulären Kommunikation

Abstract

Der Adenin-Nukleotid-Translokator (ANT) ist ein vielseitiges Protein, welches neben der Funktion als ADP-ATP-Austauscher in vielen Prozessen eine Rolle spielt. Die bekanntesten Beispiele hierfür sind die Apoptose und die Oxidative Phosphorylierung. Darüber hinaus ist bekannt, dass eine ANT1-Überexpression (ANT1-OE) unter hypoxischen Bedingungen mit vermehrt aktivierten Proteinkinasen und verringerter Apoptose einhergeht. Wie die Regulation dieser Prozesse in Abhängigkeit von ANT erfolgt, ist noch weitestgehend unbekannt. Interaktionsstudien bestätigten, dass der ANT mit einer Vielzahl zellulärer Komponenten assoziiert ist, die für das Zellüberleben essentiell sind. Besonders interessant war dabei die Assoziation des ANT1 mit den Hitzeschockproteinen (HSP) CRYAB, HSP27, HSP75 und HSP90. Da HSPs an einer Vielzahl anti-apoptotischer Mechanismen beteiligt sind, lag ein besonderer Fokus auf der Analyse dieser Proteine. Diese Arbeit zeigt, dass die ANT1-OE zu einer vermehrten Expression und Phosphorylierung von HSP27, begleitet von einer Reduktion der Caspaseaktivierung führte. Darüber hinaus ging die ANT1-OE mit einer vermehrten Bindung der kleinen HSPs an das ANT1-Interaktom einher. Dies ermöglichte unter Hypoxie eine vermehrte Freilassung dieser Komponenten aus dem Proteinkomplex und war von einer verstärkten Sekretion dieser HSPs begleitet. Sekretiertes HSP27 induzierte in ANT1tg-NRCM eine vermehrte Expression und Phosphorylierung von HSP27, sowie eine vermehrte Expression von CRYAB. Andere Komponenten des KÜAH (Kulturüberstand hypoxisch kultivierter ANT1tg-NRCM) induzierten die Aktivierung protektiver Kinasen wie AKT und Erk1/2. Darüber hinaus ging die ANT1-OE mit erhöhter Sensitivität gegenüber externe Stimuli einher. Um zu untersuchen wie die Signalweiterleitung erfolgt, wurde die Expression und die Funktion der Toll-Like-Rezeptoren (TLR) TLR2 und TLR4 analysiert. ANT1tg-NRCM zeigten im Vergleich zu WT-NRCM eine flexiblere Rezeptorexpression bei Stress, indem sie auf Serummangel mit einer vermehrten TLR2- und auf Hypoxie mit einer vermehrten TLR4-Expression reagierten. Die Blockade dieser TLRs mit OxPAPC zeigte, dass die Expressionserhöhung und Aktivierung der kleinen HSPs, von Erk1 und AKT, welche durch KÜAH vermittelt wurden, durch diese Rezeptoren an die NRCM weitergegeben wurden. Darüber hinaus führte die TLR2/4-Blockade zu einem deutlichen Anstieg der Caspaseaktivierung, was die anti-apoptotische Funktion von TLR2/4 in NRCM unterstreicht. Es wird ersichtlich, dass der ANT1 eine zentrale Komponente des intrazellulären Signalings ist, die an einer Vielzahl zellulärer Prozesse beteiligt ist. Eine besondere Funktion wird dem ANT1 als Komponente des anti- apoptotischen Signalings zuteil, da ANT1 dieses an den unterschiedlichsten Stellen modulieren kann. Dabei beeinflusst die ANT1-OE die interzelluläre Kommunikation zwischen NRCM. Dies erfolgt 1. durch die vermehrte Freisetzung von Signalmolekülen in den Kulturüberstand und 2. durch eine Veränderung der Rezeptorpräsentation, die die Zellen zusätzlich sensitiver für externe Stimuli macht. Beide Mechanismen tragen zu einer vermehrten Aktivierung protektiver Prozesse in NRCM bei und bieten Schutz vor Stressstimuli wie Hypoxie oder Serummangel. Damit bietet die kardiomyozytäre Überexpression von ANT1 großes Potential zur Behandlung ischämischer Schädigungen in Herzgewebe.

The adenine nucleotide translocase (ANT) is a multifunctional protein, which, beside its function as ADT/ATP exchanger, is involved in many other cellular processes. Some well known examples are apoptosis and oxidative phosphorylation. Previous findings indicated that overexpression of ANT1 (ANT1-OE) is associated with activation of anti-apoptotic signaling and reduced apoptosis, but it is mostly unknown how these processes are regulated dependent on ANT. Interaction analysis confirmed that ANT1 is associated with many cellular components, which are essential for cell survival. This work identified an so far unknown association of ANT1 with the small heat shock proteins (HSP) HSP27 and CRYAB, as well as an association of HSP75 and HSP90 with ANT1. Because of their role as regulators of many anti-apoptotic mechanisms, we had a special focus on these heat shock proteins. This work shows that ANT1-OE led to an increase in expression and phosphorylation of HSP27, accompanied by a decrease in caspase activation at pathophysiological conditions. ANT1-OE further led to an increased binding of small HSPs to the ANT1-interactome, which enables an increased release of those components under hypoxia. This was accompanied by higher secretion of those HSPs into the extracellular space. We further investigated that ANT1-OE influenced the intercellular communication between NRCM. Overexpression of ANT1 led to higher sensitivity to extracellular stimuli. HSP27 of KÜAH (culture supernatant generated from hypoxic cultured ANT1tg-NRCM) induced an increase of the expression of HSP27 and CRYAB, as well as an increased phosphorylation of HSP27 in ANT1tg-NRCM. Other indefinite components of KÜAH further induced an increase in activation of protective kinases like AKT and Erk1/2, again in ANT1tg-NRCM. In order to analyze the mechanism that leads to elevated sensitivity of ANT1tg-NRCM, we analyzed the expression and the function of Toll like receptors (TLR) 2 and 4. In ANT1tg-NRCM serum deprivation led to increased TLR2 expression, while hypoxia led to increased TLR4 expression, indicating that these cells exhibit a higher flexibility in presenting their TLRs under pathophysiological conditions. Inhibition of TLR-function with OxPAPC indicated that the increase in expression and activation of small HSPs, AKT, and Erk1 by stimulation with KÜAH or rhHSP27, was mediated by TLR2 and/or TLR4. Furthermore, the inhibition of TLR2/4 led to a drastic increase of caspase activation at serum deprivation and hypoxic stress. This emphasizes the anti-apoptotic function of TLR2 and TLR4. This work shows that ANT1 is a central component of the intracellular signaling, which is involved in many cellular processes. ANT1 holds a special function as component of the anti- apoptotic signaling, because it regulates this process at many different points. Our results show that overexpression of ANT1 influences the intercellular communication of NRCM. This is due to: 1. Increased secretion of signaling components to the culture supernatant, and 2. Changes in the receptor expression, which leads to higher sensitivity of ANT1tg-NRCM to extracellular stimuli. Both mechanisms take part in mediating an increase of activated protective processes in NRCM and result in protection against stresses like serum deprivation or hypoxia. This shows the high potential of ANT1 in order to reduce ischemic damages in the heart.